Bu test, bakteriyel yapı ve fonksiyonun modülasyonunu bağışıklık hücresi bazlı antibakteriyel aktiviteye bağlar. Bu nedenle, potansiyel bir tedavinin önemli bir immünoterapötik geliştirilmiş bakteriyel açıklık olasılığını belirlemede değerlendirilebilir. Opsonofagositik öldürme sadratiği geleneksel olarak bakteriye karşı yükseltilen antikorların obsonant olarak etkili işlevlerini değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.
Bu protokol, mevcut yüksek iş artışı standart testlerinde basitlik ve çok yönlülük sunar. Bu protokolde, bir ilaç tedavisinin streptokok pnömonisi üzerindeki etkilerini ve bu etkilerin bakterinin geliştirilmiş fagositozuna nasıl dönüştüğünü araştırıyoruz. Burada, OPKA'yı streptokok pnömoni hücrelerine uyguluyoruz.
Ancak bu protokol, diğer patojenlerin bağışıklık hücreleri tarafından fagositik olarak öldürülmesini değerlendirmek için kabul edilebilir. Bakteri stoklarını optimize etmek ve son CPU'ların sayılması için zaman ayırın optimum aralıkta yer alın. HL60 hücrelerinin canlı ve aktif olmasını sağlamak ve işlevsel olarak aktif hücreleri sağlamak için farklı kültür koşulları denemek için akış sitometrisini kullanmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz.
Görsel gösteri, numunenin nasıl kaplanacak ve sayılabilir örneklerin nasıl elde edilebildiğini daha iyi anlama sağlayacaktır. Başlamak için, L-glutamin ve 15 mililitre ısı inaktive fetal sığır serumu ile desteklenen 500 mililitre RPMI oluşan HL60 hücre kültürü medya hazırlamak. HL60 hücrelerinin yayılması ve bakımı için, 75 santimetre kare lik hl60 hücre kültürü medyasının 10 mililitresinde beş milyon hücre, 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit leğenli şişeleri boşaltTı.
HL60 hücrelerinin çalışma stokları oluşturmak için, HL60 kültür medya% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenen bir mililitre kriyojenik tüpler içine mililitre başına yaklaşık bir milyon hücre ekleyin. HL60 hücrelerini ayırt etmek için, kültür 1.5 kat 10 HL60 hücre kültürü medya 15 mililitre yedi hücreye steril filtre% 0.6 DMF ile desteklenmiş 75 santimetre kare şişeleri 37 santigrat derece ve 5% karbondioksit üç gün önce OPKA için. Bakteriyel stok örnekleri hazırlamak için, 37 santigrat derece yaklaşık 2-4 saat boyunca uygun bir et suyu WU2 bakteri suş büyümek.
Daha sonra, iki dakika için altı bin kez G santrifüj ile bakteri pelet ve uygun suyu% 15 gliserol 10 ila 30 mililitre hücreleri askıya. Aliquot steril içine bakteri kültürü 1.5 mililitre santrifüj tüpler ve saklamak 80 santigrat derece. Sonra, 37 derece santigrat su banyosunda bir şişe bakteri stoku eritin.
Pellet bakteri hücreleri ve steril koşullar altında OBB 500 mikrolitre resuspend. Kan agar plakaları üzerinde tedavi edilmemiş bakteri stokunun plaka seyreltmeleri ve kültür tabakları bir gecede 30 santigrat derece. Kuluçka adımından sonra, hl60 hücreleri ile birlikte kültüre işlenmemiş bakteriyel stok her seyreltme için koloniler saymak.
Bu bakteri stoğu ile gelecekteki OPK'lar için en uygun sayıda bakteri nin seyreltilmesinin en uygun sayıda kisiye verim verdiğini kaydedin. Bir tüp bakteri stokunu erit. Pelet bakterileri iki dakika boyunca altı bin kez G'de bulunur ve obb'deki hücre peletini bir önceki adımda elde edilen optimum seyreltmede yeniden askıya alın.
Pipet yuvarlak bir alt 96 iyi hücre kültürü plaka iyi başına resuspended bakteriyel seyreltme 10 mikrolitre. Daha sonra, her deneysel kuyuya uygun bir antikor veya ilaç tedavisinin 20 mikrolitresini ekleyin. Kontrol kuyuları için, tedavi kuyuları için kullanılan tamponbağlı olarak 1XPBS veya OBB kullanın.
Bir saat boyunca oda sıcaklığında yaklaşık 90 rpm örnek plaka sallayın. Üç gün önce DMF ile tedavi edilen HL60 farklılaştırılmış hücreleri hasat etmek için hücreleri 500 kez G'de üç dakika peletleyin. Supernatant atın ve 1XPBS en az 10 mililitre ile pelet yıkayın.
Yıkanmış hücreleri 3 dakika boyunca 500 kez G'de peletleyin. Supernatant atın ve OBB hücreleri yeniden askıya. Steril seyreltilmemiş bebek tavşan serumu bir ila beş son cilt ekleyin.
Bir saat bakteri kültürü sonra, iki grup için yinelenen kuyular halinde her örnek bölün. Daha sonra, her bir deney seti kuyulara 50 mikrolitre HL60 kompleman karışımı ve sadece bakteri kuyularına 50 mikrolitre OBB ekleyin. Bir saat boyunca 37 santigrat derece 96 kuyu plaka sıkış.
Plaka örnekleri için, her numunenin en az 50 mikrolitre lik bir hacme sahip olması için OBB ile her kuyuya 1-5 son hacimde seyreltin. Daha sonra, pipet 50 mikrolitre her numune doğrudan bir bakteri kültürü plaka belirli bir alana, numuneler arasında yeterli boşluk sağlanması. Kapak ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurulamak için örnekler sağlar.
Tabakları ve kültürü bir gecede 30 derecede tersine çevirin. Alternatif olarak, anoksik koşulların bakteri büyümesini etkileyip etkilemediğini veya morfolojiyi kontrol edip etmediğini test etmek için anaerobik kavanozlarda kültür plakaları. Bir gecelik kültürden sonra, belirlenen her örnek alandaki kolonileri sayın ve her kümedeki canlı hücre sayısını ilgili denetimlerle karşılaştırarak verileri çözümlemeye geçin.
Bu tekniği ilk kez oluşturmanın en zor yönleri büyük olasılıkla bakteri stokunun başlangıç CPU'larını optimize etmek ve HL60 hücrelerinin etkin bir şekilde farklılaşmasını sağlamak olacaktır. OPKA'ya başlamadan önce HL60 farklılaşması proidium iyodürlü akış sitometrisi kullanılarak uygulanabilirlik belirteci olarak doğrulandı. Üç gün DMF ile tedavi edildikten sonra CD35 ekspresyonu artırıldı ve CD71 ekspresyonu azaltıldı.
HL60 tedavi edilen gruplardaki bakteriyel CPU'ların ortalama yüzdeleri, farklı tedavilerin bakteri hücre sağkalımını karşılaştırmak için hl60'a ait olmayan tedavi gruplarına göre kullanılmıştır. Sonuçlar, etkili bir tedavi ile koloni lerin sayısının HL60 ortak kültürü ile HL60 hücreleri arasında farklı olduğunu ve daha verimli fagositon olduğunu göstermiştir. Sonuçlar, bakteriyel seyreltme optimize edilmediğinde veya koloni büyümesinin kaplamadan sonra dikkatle gözlemlenmediğini, kolonilerin aşırı büyümesinin kolonilerin doğru sayımını önleyebileceğini göstermiştir.
Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, CUV'ların aşırı büyümesini önlemek için bakteri kuluçkasını dikkatle izlemektir. In vivo tahliller bir konak içinde etkili bakteriyel açıklık asses için kullanılabilir. Bu tahliller OPKA ile gözlenen bağışıklık etkinliğini doğrulamak için kullanılabilir insan veya hayvan modelleri ne dönüştürülebilir.
Opsonofazor öldürücü köz, antibakteriyel tedavileri fagostik immün yanıtlara bağlamak için önceki önemli araştırma çalışmalarında büyük etki yaratmıştır. Bakteriyel patojenlerle çalışmak tehlikeli olabilir. Lütfen bu test sırasında her zaman koruyucu kişisel ekipman giyin.
