KP y como escribieran y revisaron el manuscrito. KP realiza los experimentos y el análisis. Este trabajo fue apoyado por el Premio de transición de carrera de institutos nacionales de salud (NIH) (K22AI112816) a AS.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de California, Irvine.
1. tampones y soluciones
<ol><li>Para preparar caldo de lisogenia (LB) en un frasco de vidrio de 1 L agregar 25 g de mezcla LB-Miller en 1 L de agua destilada doble (ddH2O). Para placas de Petri, agregar un adicional 20 g de agar. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de medio agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar medios líquidos a temperatura ambiente y las placas de agar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar platos para glucosa levadura peptona (GYP) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 1 g de D-glucosa, extracto de 2 g de peptona, 0,25 g de levadura, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g de Na2HPO47 H2O y 25 g de agar en 1 L de ddH2 O. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparación de medio de peptona S (PS) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 10 g de peptona, extracto de 7 g de levadura, 15 g de D-glucosa, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 μg de vitamina B12 , y 80 μg de ácido fólico en 800 mL de ddH2O. calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.<ol>
<li>Medir el pH del medio PS utilizando el medidor de pH. Añadir KOH de 5 M o 5 M H3PO4 para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2filtro de O. esterilice usando 0.22 μm filtro vacío y almacenar a 4 ° C. Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 10 x Buffer de desarrollo primer (DB') buffer en una botella de vidrio de 1 litro mediante la adición de 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O y ddH2O hasta un volumen total de 800 mL. Calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.<ol>
<li>Medir el pH del buffer usando el medidor de pH electrónico. Suavemente agregar KOH de 5 M o 5 M H3PO4 según sea necesario para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH2O y esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente. Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hacer 1 x de tampón de desarrollo (DB) mezclando 100 mL de 10 x DB' buffer con 1 mL de esterilizada 2 M MgCl2, y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl2. Ajustar el volumen final de 1 L en una botella de vidrio de 1 L con un ddH esterilizada en autoclave2O. almacén a temperatura ambiente.</li>
	<li>Medio PS:DB en una botella de vidrio de 1 L se preparan mezclando 100 mL de medio de PS estéril, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer y ddH esterilizada2O hasta un volumen total de 1 L. suplemento con 1 mL de esterilización de MgCl 2 M2 y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl 2. almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar la solución madre de calceína-AM por añadiendo 50 μl de DMSO a 50 μg de calceína-AM en el envase plástico proporcionado por el fabricante. Almacenar a-20 ° C.</li>
</ol>2. crecimiento y mantenimiento de las amebas
<ol><li>Crecer la cepa de e. coli B/r17 como fuente de alimento para las amebas durante el período de crecimiento inicial. Racha de e. coli B/r de un stock congelado almacenados a-80 ° C sobre una placa de agar LB e incubar a 37 ° C durante la noche para obtener colonias individuales.</li>
	<li>Inocular una sola Colonia de e. coli B/r en 2 mL de medio LB e incubar en un tambor de rodillo o una coctelera a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Llevar durante la noche de cultura de e. coli a la temperatura ambiente. Usando un palo de madera, inocular amebas de un stock congelado guardado a-80 ° C en 750 μl de la cultura durante la noche. Nota: Uso D. discoideum cepa AX3, que es capaz de crecimiento axénico18. Este paso no requiere crecimiento axénico, pero los pasos posteriores tendrán su requisito.</li>
	<li>Inmediatamente añadir 700 μl de la mezcla dee. coli de amebas - sobre una placa de glucosa levadura peptona (GYP). Difundir la cultura uniformemente en la superficie de la placa inclinándola y hacia atrás y de lado a lado según sea necesario. Evitar el uso de un esparcidor.</li>
	<li>Coloque la placa GYP con el agar hacia arriba en una caja que mantiene la humedad. Utilizar dos envases de plástico desechables (183 cm x 183 cm x 91 cm) apilados en la parte superior unos a otros. Llene el recipiente inferior con aproximadamente 25 mL de agua y colocar el contenedor superior con varios 0,5 cm de diámetro agujeros perforados a través del suelo del recipiente para permitir que la humedad mover el tanque de agua en el contenedor superior.</li>
	<li>Incubar la placa de GYP y caja de 22 ° C durante 4-5 días hasta que las esporas de la ameba se observan creciendo cerca de la superficie de la placa (figura 2). Utilizar una incubadora refrigerada para incubar las placas en lugar de incubación a temperatura ambiente. Nota: Después de que las esporas han crecido, siguen siendo viables en las placas durante varias semanas si se almacena a 4 ° C. Almacenar las placas con agar hacia arriba. Después de 3-4 días de incubación, se observan zonas de claro en el césped bacteriano, que indican el inicio de la esporulación de la ameba.<ol>
<li>Observar amebas pequeñas esporas sobre la superficie de la placa tras 4-5 días de incubación (figura 2). Nota: Crecen las amebas por más de una semana, como la calidad de las esporas disminuye más allá de este período de tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger las esporas de las amebas para prepararse para el crecimiento axénico de las amebas por barrido paralelo a la superficie de la placa de una punta de pipeta estéril 1 mL. Recoger las esporas de la mitad de un plato de Petri de 10 cm. Nota: Evite tocar la punta de la superficie de la placa de agar como esta propuesta recogerá gran cantidad de e. coli.</li>
	<li>Resuspender las amebas en la punta de la pipeta por sumergir la punta en 1 mL de medio de PS y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Transferir la mezcla inoculada en un frasco de 250 mL que contenga 25 mL del medio PS complementado con la solución de antibiótico-antimicótico en concentración x 0.25. Nota: Almacene la solución antibiótico-antimicótico como alícuotas de μl 250 a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de descongelación y congelación de esta solución como esto puede disminuir su eficacia.</li>
	<li>Crecen amebas axenically a 22 ° C en un agitador rotatorio a 100 rpm. Para el análisis de la virulencia en el paso 5, crecen las células a una densidad óptica medida a 600 nm (OD600) de 0.2 a 0.5. Nota: Este paso requiere 3-4 días de crecimiento desde el momento de la inoculación (paso 2.7). Si las células han crecido a una densidad más alta, diluir la cultura en el medio PS a un OD600 de 0.05 o menor y crecer a un OD600 de 0.2 a 0.5.</li>
</ol>3. el crecimiento de p. aeruginosa
<ol><li>Escoger una sola Colonia de p. aeruginosa de una placa LB, inocular en una cultura de PS:DB de 2 mL y crecer durante la noche a 37 ° C a la saturación. Nota: No agregue la solución antibiótico-antimicótico para los medios de PS:DB.</li>
	<li>Diluir la noche cultura 1: 100 o 1:1,000 en un plato de Petri de 6 cm de diámetro utilizando PS:DB. Si únicamente se es analizar la virulencia de las células planctónicas, crecen las culturas usando tubos de cultivo convencional en su lugar. Sacudir la cultura en un rotador de benchtop de 100 rpm a 37 ° C.</li>
	<li>Culturas en momentos específicos para asegurar la reproducibilidad de la cosecha. A los 30 min a 1 h antes de la evaluación de virulencia, preparar una almohadilla de agar como se describe en la sección 4. Nota: Virulencia en p. aeruginosa es inducida por aproximadamente 8 h de crecimiento en las superficies.</li>
	<li>Para aislar las células conectado a superficie, quite el medio líquido de la caja Petri, lavar de inmediato con 1 mL de tampón de DB para eliminar las células planctónicas y proceder de inmediato al paso 5.1. PRECAUCIÓN: No lave más de 30 s como este se perturban y separar células conectado en superficie y puede afectar la medición de la virulencia.</li>
	<li>Para aislar las células planctónicas, transferir 10 μl de la cultura de la placa de Petri a una caja de Petri limpia y proceder de inmediato al paso 5.1.</li>
</ol>4. microscopía - preparación de la almohadilla de Agar
<ol><li>Preparar pastillas de agar aproximadamente 30 min a 1 h antes de las amebas están listas para ser mezclados con p. aeruginosa.</li>
	<li>Microondas 50 mL de agar 1% (p/v) en buffer DB en un matraz de 250 mL. Mezcla cada 20 s hasta grupos de agar desaparecen.</li>
	<li>Enfriar el agar fundido al colocarlo en baño de agua precalentada 55 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 15 μl de la solución madre de calceína-AM a 15 mL del agar fundido en un tubo cónico. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 4 - 5 veces y proceder de inmediato al siguiente paso. Nota: Realice este paso en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL. No use un recipiente de vidrio grueso ya que el agar solidifique demasiado rápido.</li>
	<li>Vierta la mezcla de agar fundido en la parte superior una placa de vidrio de 12 cm x 10 cm y permitir que el agar solidifique durante 10 minutos a temperatura ambiente. Cortar la almohadilla de agar solidificado en secciones más pequeñas de 1,5 cm x 1,5 cm colocando la placa de vidrio sobre una cuadrícula impresa y corte a lo largo de la rejilla usando una regla de metal.</li>
	<li>Mantenga el gel hidratado en una caja húmeda hasta que esté listo para su uso.</li>
</ol>5. microscopía - preparación de la muestra de Bacteria ameba imagen
<ol><li>Para la virulencia de células bacterianas con conexión por superficie de ensayo, añadir 10 μl de células de Ameba de paso 2.10 bacterias conectado a superficie del paso 3.4. Nota: Este paso describe la mezcla de amebas con las bacterias.</li>
	<li>Para analizar la virulencia de las células planctónicas, mezclar 10 μl de las células de la ameba de paso 2.10 con 10 μl de las bacterias planctónicas de paso 3.5. Nota: No lave las células cultivadas axenically Ameba (en un OD600 de 0.2 a 0.5) antes de mezclar con la bacteria. No crecimiento de e. coli se observará en la cultura de Ameba debido al uso de la solución de antibiótico-antimicótico.</li>
	<li>Inmediatamente colocar la almohadilla de agar de calceína-AM 1,5 cm x 1,5 cm de paso 4.5 sobre la mezcla de bacterias-ameba en la superficie de la placa de Petri. Nota: Coloque la almohadilla de agar en la parte superior la mezcla utilizando un movimiento suave de rápido. Este movimiento tiende a empujar las células hacia la periferia y de la parte inferior de la almohadilla, no baje la almohadilla lentamente en la mezcla. Este paso garantizará que las bacterias y las amebas son uniformemente mezclados, inmovilizada y que ambos tipos de células están confinadas en el mismo plano.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido mediante pipeteo suavemente hacia fuera cualquier líquido restante alrededor de la almohadilla de agar. Permita que la placa de Petri secar por 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cubrir con la placa de Petri con tapa e incubar la mezcla inmovilizados ameba-bacterias a temperatura ambiente durante un adicional 40 min. proceda al paso 6.1. Nota: Es importante incubar las muestras durante la misma cantidad de tiempo, como el fondo fluorescencia aumenta con el tiempo. Se recomienda un tiempo de incubación de 1 h. Incubaciones por más de 1 h son menos reproducibles como las células de las amebas pueden empezar a explotar.</li>
</ol>6. microscopia - adquisición de imágenes
<ol><li>Amebas de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia capaz de adquirir imágenes de fluorescencia verde y trasmitida. Para fluorescencia verde, usar filtros de fluorescencia verde (GFP) de la proteína con 474/27 nm y 525/45 nm de excitación y emisión, respectivamente. Utilice un objetivo de (apertura numérica ≥0.3) X 10 a la imagen de las amebas. Nota: La calceína-AM en el agar causará muerte amebas a fluorescencia en el canal de fluorescencia verde. Amebas sanas de lo contrario no son fluorescentes.</li>
	<li>Ajustar tiempos de adquisición para el contraste de fase, canales GFP para limitar fototoxicidad y optimizar el rango dinámico de las intensidades de la imagen. Sustituir el interferencia diferencial (DIC) fase contraste si es necesario. Nota: Usar exposiciones de 100-200 ms contraste de fases y fluorescencia de GFP si es posible. Mantener los ajustes de exposición e instrumento sin cambios a lo largo de todo el experimento. Esto es fundamental para calcular el índice de homicidio de host.</li>
	<li>Adquirir imágenes de por lo menos 100 células de Ameba para obtener buenas estadísticas para calcular el host índice de matanza.</li>
</ol>7. Análisis e índice de la matanza de Host de la imagen
<ol><li>Cabo el análisis de imagen con ImageJ.</li>
	<li>Abra el archivo de imagen de contraste de fase en ImageJ haciendo clic en archivo | Abierto y seleccionar la imagen. Ajustar el umbral haciendo clic en imagen | Análisis | Umbral. Ajustar el umbral superior e inferior para seleccionar sólo el pico de intensidad (figura 3A).</li>
	<li>Convertir la imagen a binario haciendo clic proceso | Binario | Hacer binario. Rellenar agujeros seleccionando proceso | Binario | Llenar los agujeros. Nota: Utilizando la imagen en la figura 1 como el origen, pasos 7.1-7.2 producirá una imagen en la que las amebas y las bacterias superficie adjunta aparecen como las regiones oscuras (figura 3B).</li>
	<li>Asegurar que los cuadros de área y valor del gris medio se incorporan analizar | Establecer las medidas. Medir el tamaño aproximado de las amebas seleccionando la herramienta óvalo de la barra de herramientas principal. Haga clic en analizar | Medida y observe la zona de amebas representante.</li>
	<li>Crear máscaras para las amebas haciendo clic analizar | Analizar las partículas. En el cuadro tamaño, escriba el área que se incluyen las amebas pero excluyen las bacterias. Seleccionar máscaras en el menú desplegable de la opción de mostrar. Asegúrese de que está marcada la casilla añadir a gerente .</li>
	<li>Haga clic en OK y una imagen que muestra sólo las amebas y un ROI Manager aparecerá el cuadro de diálogo (figura 3C).</li>
	<li>Abra la imagen de la fluorescencia usando archivo | Abierto y seleccionar el archivo correspondiente. Seleccionar todas las regiones en el ROI Manager manteniendo pulsada la tecla Mayús y clic en cada región en la lista (figura 3D).</li>
	<li>Haga clic en el botón de medir en el ROI Manager. Se abrirá una ventana de resultados muestra el valor de la intensidad media de cada ameba.</li>
	<li>Copiar los valores de fluorescencia para cada ameba en un programa de hoja de cálculo y calcular el anfitrión matando índice tomando el promedio de todos los valores de fluorescencia.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método rápido y cuantitativo para analizar la virulencia en p. aeruginosa. Este protocolo puede ser probado con otras bacterias. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el medio de crecimiento debe ser compatible con las condiciones de crecimiento de la ameba. En particular, hemos optimizado el protocolo usando PS:DB como el medio de crecimiento bacteriano. Si se utilizan otros medios, puede ser necesario realizar un control del crecimiento sólo de los medios de comunicación...

La infección bacteriana es una de las principales causas de mortalidad en humanos y animales1,2. La capacidad para medir la virulencia de las bacterias en cultivos o biofilms es importante en entornos de cuidado de la salud y la investigación. Aquí, describimos un método versátil, rápido y relativamente simple para cuantificar la virulencia bacteriana. El organismo eucariota Dictyostelium discoideum (ameba) se utiliza como organismo modelo host. D. discoideum se ha utilizado como un host para identificar factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 y otras bacterias6,7 ,8 y es susceptible a en gran parte los mismos factores de virulencia que matan las células mamíferas, incluyendo el tipo III secreción9,10. Anteriores ensayos de virulencia mediante D. discoideum han implicado la exposición prolongada de las bacterias con D. discoideum las células en el transcurso de horas3,4,5. Protocolo, aquí, presenta un método rápido de determinación de virulencia usando esta ameba. Este protocolo (figura 1) se describe como: (1) crecen las amebas axenically (en ausencia de bacterias), (2) crecer bacterias para el análisis, (3) preparar las bacterias y las células del huésped para microscopía, (4) realizan microscopía de epifluorescencia y (5) analizan los ameba fluorescencia.
Amebas inicialmente con mechas hacia fuera de la acción congelada y crecidas en un jardín de Escherichia coli (e. coli), donde las amebas producen esporas. Estas esporas son seleccionadas y se inocula en un medio enriquecido para el crecimiento axénico. Las amebas se mantienen a través del crecimiento axénico en condiciones ricas en nutrientes hasta que están listos para ser mezclados con bacterias para la evaluación de la virulencia bacteriana. La supervivencia o la muerte de las amebas se cuantifica midiendo la fluorescencia de calceína-acetoxymethyl (calceína-AM), que es hendida por esterasas intracelulares y, por lo tanto, activado por fluorescencia11,12. Amebas vivo exhiben poca o ninguna fluorescencia mientras que subrayó y fluorescencia de células muertas intensamente. Este resultado es debido a poca o ninguna incorporación de calceína-AM en amebas saludables e incorporación y clivaje del sustrato en amebas estresado13. Este comportamiento es notablemente distinto de fluorescencia de calceína-AM en células de mamífero11,14,15,16.
Las bacterias que se aplicará para la virulencia se cultivan por separado. Aquí, describimos cómo medir la virulencia de los patógenos oportunistas p. aeruginosa y detalle cómo cuantificar la virulencia de planctónico (natación) y las subpoblaciones conectado a superficie. Este protocolo puede ser adaptado para probar la virulencia de otras bacterias. En la sección de resultados de representante, demostramos que la virulencia se activa en las células de superficie conectado y es baja en las células planctónicas, que fue divulgado previamente13. Virulencia-activado superficie unida p. aeruginosa mata amebas mientras no virulenta células planctónicas son consumidas por las amebas. Si únicamente se es analizar la virulencia de las bacterias planctónicas, las bacterias pueden ser cultivadas en tubos de cultivo ordinario en lugar de utilizar placas de Petri como se describe en el protocolo.
El crecimiento de las amebas y las culturas de p. aeruginosa debe coordinarse que cultivos de p. aeruginosa alcanzan la fase de crecimiento previsto, mientras que las amebas están creciendo en estado estacionario en condiciones ricas en nutrientes. Esta condición requiere típicamente culturas amebas a diluirse al menos 1 día antes cuando se mezclan con las bacterias. Amebas y bacterias se inmovilizan usando teclas de agar son co se incubó por 1 h y fotografiado con una resolución baja (10 X, abertura numérica 0.3) filtros de la proteína de fluorescencia verde, objetiva (GFP) y una cámara. Análisis se pueden realizar usando el software ImageJ libremente disponible o modificado para requisitos particulares software de análisis de imagen. Nuestro análisis fue realizado usando nuestro propio software escrito usando un paquete de análisis científico13. El software debe crear una máscara con la imagen de contraste de fase y extraer valores de fluorescencia de las áreas enmascaradas en la imagen de fluorescencia. Valores de fluorescencia son un promedio sobre por lo menos 100 células, resultando en un índice de matanza de host numéricos.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

Ensayos de virulencia bacterianos tradicionales implican la exposición prolongada de las bacterias a lo largo de varias horas a las células del huésped. Durante este tiempo, las bacterias pueden experimentar cambios en la fisiología debido a la exposición al ambiente de crecimiento de anfitrión y la presencia de las células hospedadoras. Hemos desarrollado un ensayo para medir rápidamente el estado de virulencia de las bacterias que reducen al mínimo el grado al cual las bacterias crecen en presencia de las células del huésped. Bacterias y amebas se mezclan juntos e inmovilizadas en un solo plano de proyección de imagen con una almohadilla de agar. El procedimiento utiliza imágenes por fluorescencia unicelular con calceína-acetoxymethyl ester (calceína-AM) como un indicador de salud de la célula huésped. La fluorescencia de las células huésped se analiza después de 1 h de la exposición de las células del huésped a las bacterias mediante microscopía de epifluorescencia. Software de análisis de imagen se utiliza para calcular un índice de matanza de host. Este método se ha utilizado para medir la virulencia dentro de planctónicos y une superficie de Pseudomonas aeruginosa las subpoblaciones durante la etapa inicial de formación de biopelículas y puede ser adaptado a otras bacterias y otras etapas del crecimiento de biopelícula. Este protocolo proporciona un método rápido y robusto para medir la virulencia y evita muchas de las complejidades asociadas con el crecimiento y mantenimiento de líneas de células de mamífero. Fenotipos de virulencia mide aquí con las amebas también han sido validados con los macrófagos de ratón. En particular, este análisis fue utilizado para establecer esa virulencia de upregulates accesorio superficie en p. aeruginosa.

Hemos crecido salvaje p. aeruginosa cepa PA1419 o un ΔlasR cepa20 en el mismo fondo de PA14 en cajas Petri de 6 cm de diámetro y se analiza la virulencia de las células planctónicas y conectado a superficie. Culturas fueron inoculadas de colonias solo en las culturas PS:DB, cultivadas durante la noche en tubos de cultivo en un tambor de rodillo a 37 ° C saturación, diluido 1: 100 en PS:DB, cultiva para 8 h de 6 cm de ...

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K vistas.  University of California. Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Seguimiento y cuantificación a largo plazo de la motilidad de las especies de Acanthamoeba

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Estudio del comportamiento de Acanthamoeba para desarrollar estrategias específicas para prevenir la queratitis por Acanthamoeba

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Resumen

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Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad

Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad

Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad