Dieser Test verbindet die Modulation der bakteriellen Struktur und Funktion mit immunzellbasierter antibakterieller Aktivität. Als solche kann ein wichtiges Immuntherapeutika einer potenziellen Behandlung bei der Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer verbesserten bakterielleclearance beurteilt werden. Opsonophagozytäre Tötungassay dient traditionell als Goldstandard für die Bewertung effektiver Funktionen von Antikörpern, die gegen das Bakterium als obsonant erhoben werden.
Dieses Protokoll bietet Einfachheit und Vielseitigkeit gegenüber bestehenden standardisierten Assays mit hohem Durchsatz. In diesem Protokoll untersuchen wir die Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung auf Streptokokken-Pneumonie und wie diese Effekte zu einer verbesserten Phagozytose des Bakteriums führen. Hier wenden wir das OPKA auf Streptokokken-Lungenentzündungszellen an.
Dieses Protokoll kann jedoch angenommen werden, um die phagozytische Tötung anderer Krankheitserreger durch Immunzellen zu bewerten. Widmen Sie sich Zeit, um die Bakterienbestände zu optimieren und sicherzustellen, dass die zu zählenden endgültigen KBE in den optimalen Bereich fallen. Wir empfehlen dringend, die Durchflusszytometrie zu verwenden, um sicherzustellen, dass HL60-Zellen lebensfähig und aktiv sind und verschiedene Kulturbedingungen ausprobieren, um funktionell aktive Zellen zu gewährleisten.
Die visuelle Demonstration wird ein besseres Verständnis dafür vermitteln, wie die Probe plattiert werden sollte und wie zählbare Proben erreicht werden können. Zu Beginn bereiten SIE HL60 Zellkultur-Medien bestehend aus 500 Milliliter RPMI ergänzt mit L-Glutamin und 15 Milliliter Hitze inaktiviert fetale Rinderserum. Zur Vermehrung und Wartung von HL60-Zellen, Kultur fünf Millionen Zellen in 10 Milliliter HL60 Zellkultur Medien in 75 Quadratzentimeter entlüfteten Kolben bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.
Um Arbeitsbestände an HL60-Zellen zu erzeugen, fügen Sie etwa eine Million Zellen pro Milliliter in HL60-Kulturmedien, ergänzt mit 10%dimethylsulfoxid, in einen Milliliter kryogenen Röhren ein. Zur Unterscheidung von HL60-Zellen, Kultur 1,5 mal 10 zu den sieben Zellen in 15 Milliliter n.HL60 Zellkultur Medien ergänzt mit 0,6%DMF in sterilen Filter gekappt 75 Quadratzentimeter Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Tage vor OPKA. Zur Vorbereitung der bakteriellen Bestandsproben den WU2-Bakterienstamm in einer geeigneten Brühe etwa zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius anbauen.
Als nächstes pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei sechstausend Mal G für zwei Minuten und suspendieren die Zellen in 10 bis 30 Milliliter 15%Glycerin in der entsprechenden Brühe. Aliquot die Bakterienkultur in sterile 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre und lagern bei 80 Grad Celsius. Als nächstes tauen Sie eine Durchstechflasche mit Bakterienvorräten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auf.
Pellet die Bakterienzellen und resuspendieren in 500 Mikroliter OBB unter sterilen Bedingungen. Plattenverdünnungen des unbehandelten Bakterienbestandes auf Blutagarplatten und Kultur der Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius. Zählen Sie nach dem Inkubationsschritt die Kolonien für jede Verdünnung unbehandelter Bakterienbestände, die mit HL60-Zellen kokultiviert werden.
Zeichnen Sie auf, welche Verdünnung von Bakterien die optimale Anzahl zählbarer Kolonien für zukünftige OPKAs mit diesem Bakterienbestand ergibt. Eine Röhre mit Bakterienbestand auftauen. Pelletbakterien bei sechstausend Mal G für zwei Minuten und resuspendieren das Zellpellet in OBB bei der optimalen Verdünnung im vorherigen Schritt erhalten.
Pipette 10 Mikroliter der resuspendierten bakteriellen Verdünnung pro Brunnen in einer runden unteren 96 Brunnenzellkulturplatte. Fügen Sie dann 20 Mikroliter eines geeigneten Antikörpers oder einer medikamentösen Behandlung zu jedem experimentellen Brunnen in doppelter Weise hinzu. Für Steuerbrunnen verwenden Sie 1XPBS oder OBB, abhängig von dem Puffer, der für die Behandlungsbrunnen verwendet wird.
Schütteln Sie die Probenplatte bei ca. 90 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für eine Stunde. Um die HL60 differenzierten Zellen zu ernten, die drei Tage zuvor mit DMF behandelt werden, pellet die Zellen drei Minuten lang bei 500 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit mindestens 10 Millilitern 1XPBS.
Pellet die gewaschenen Zellen bei 500 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in OBB erneut aus. Fügen Sie steriles unverdünntes Babykaninchenserum in einem ein bis fünf Endvolumen hinzu.
Nach einer Stunde Bakterienkultur, teilen Sie jede Probe in doppelte Brunnen für zwei Gruppen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter der HL60-Ergänzungsmischung zu jedem experimentellen Satz von Brunnen und 50 Mikroliter OBB nur zu den Brunnen von Bakterien hinzu. Schütteln Sie die 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Um Plattenproben, verdünnen Sie jeden Brunnen mit OBB in einem bis fünf Endvolumen, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 Mikroliter hat. Als nächstes Pipette 50 Mikroliter jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer bakteriellen Kulturplatte, um einen angemessenen Abstand zwischen den Proben zu gewährleisten. Bedecken und Proben ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
Umkehren Sie die Teller und Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius. Alternativ können Kulturplatten in anaeroben Gläsern testen, ob anoxische Bedingungen das Bakterienwachstum beeinflussen oder um die Morphologie zu kontrollieren. Zählen Sie nach der Nachtkultur die Kolonien in jedem ausgewiesenen Stichprobenbereich, und analysieren Sie die Daten, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Satz mit den entsprechenden Steuerelementen vergleichen.
Die schwierigsten Aspekte bei der Ersteinführung dieser Technik werden wahrscheinlich die Optimierung der Ausgangs-KGE des Bakterienbestands sein und sicherstellen, dass die HL60-Zellen effektiv differenziert werden. Vor dem Start des OPKA wurde die HL60-Differenzierung mittels Durchflusszytometrie mit Propidiumjodid als Lebensfähigkeitsmarker validiert. Nach der Behandlung mit DMF für drei Tage wurde die Expression von CD35 erhöht und die Expression von CD71 verringert.
Die durchschnittlichen Prozentsätze der bakteriellen KBE in den HL60 behandelten Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden nicht-HL60 behandelten Gruppen wurden verwendet, um das Überleben der bakteriellen Zell verschiedener Behandlungen zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einer wirksamen Behandlung die Anzahl der Kolonien zwischen DER HL60-Kokultur und den wenigen HL60-Zellen unterschiedlich war, was auf eine effizientere Phagozytose hindeutet. Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn die bakterielle Verdünnung nicht optimiert wurde oder das Koloniewachstum nach der Beschichtung nicht sorgfältig beobachtet wurde, das Überwuchern der Kolonien eine genaue Zählung der Kolonien verhindern konnte.
Das Wichtigste, was sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, die bakterielle Inkubation sorgfältig zu überwachen, um ein Überwuchern der KBE zu vermeiden. In-vivo-Assays können verwendet werden, um eine effektive bakterielle Clearance innerhalb eines Wirts zu beschüben. Diese Assays können verwendet werden, um die mit dem OPKA beobachtete Immunwirksamkeit zu bestätigen, die auf menschliche oder tierische Modelle übertragbar sind.
Der opsonophagozytäre Tötungstest wurde in früheren bedeutenden Studien mit großer Wirkung verwendet, um antibakterielle Therapien mit phagostischen Immunantworten zu verknüpfen. Die Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern kann gefährlich sein. Bitte tragen Sie während dieses Testes jederzeit eine persönliche Schutzausrüstung.
