Este protocolo presenta MALs de intercambio iónico, un método novedoso para el control y caracterización de la calidad de las proteínas, control de calidad que es esencial para la consistencia e integridad de los resultados en la investigación de ciencias de la vida y el desarrollo de productos farmacéuticos. EL MALS de intercambio de iones determina la pureza de la proteína, el estado oligomérico, la homogeneidad, la identidad, la conformación, la estructura, las modificaciones posteriores a la traducción y otras propiedades. Las mediciones no son destructivas y se realizan en solución en condiciones de amortiguación casi fisiológicas.
Este método determina con precisión la masa molar de proteínas o péptidos, el estado oligomérico y el grado de conjugación, por ejemplo, glicoproteínas. También se puede aplicar a proteínas de membrana. IEX separa las macromoléculas por su carga superficial.
El intercambio de aniones, AIEX y el intercambio catiónicos, CIEX, las matrices se unen negativa y positivamente a las variantes cargadas, respectivamente. Con una separación fina entre las poblaciones de proteínas que comparten una masa o forma relativamente cercana, IEX-MALS determina con éxito la masa molar de cada estado proteico individual en una muestra de mezcla. Para comenzar, utilice un filtro de 0,1 micrómetros para filtrar todos los reactivos, incluidos los tampones de lavado y elución.
Filtrar los primeros 50 a 100 mililitros de tampón en una botella de desecho para eliminar las partículas de los filtros secos. En una botella limpia y estéril que se ha lavado a fondo con agua filtrada y tapada para evitar que el polvo entre, filtre el resto del tampón. Con pH-ocho tampón Tris y cloruro de sodio de 50 milivolares, diluir una muestra de BSA a seis miligramos por mililitro para que el pH y la fuerza iónica permitan la unión a la columna de intercambio iónico.
Utilice una jeringa para inyectar al menos 0,3 a 0,5 miligramos de BSA en una columna de un mililitro para lograr un análisis MALS de buena calidad. Para iniciar un experimento MALS de intercambio iónico, abra Nuevo, Experimento desde método en el software MALS y seleccione el método en línea en la carpeta Métodos del sistema de dispersión de luz. Si el módulo DLS está disponible y se van a adquirir datos DLS, seleccione el método en línea en la subcarpeta Light Scattering, With QELS.
Para establecer los parámetros, en la sección Configuración, establezca primero el caudal de la ejecución en la sección Bomba genérica en el caudal utilizado en el FPLC como 1,5 mililitros por minuto. En la sección Disolvente, especifique o verifique los parámetros del búfer. En la sección Inyector, introduzca el nombre de la proteína como BSA, el incremento del índice de refracción como 0,185 mililitros por gramo y el coeficiente de extinción UV en la longitud de onda de 280 nanómetros como 0,66 litros por gramo por centímetro.
En la pestaña Muestra, introduzca la concentración de la muestra de proteína como seis miligramos por mililitro y, a continuación, inserte el volumen de la muestra para inyección como 170 microlitros también. En la sección Procedimientos, en la ficha Recopilación básica, active la casilla Desencadenar en inyección automática y establezca la duración de la ejecución en 70 mililitros para que la recopilación de datos se continúe durante al menos cinco minutos después de que el degradado haya alcanzado su valor final. A continuación, en el software FPLC, cree un nuevo experimento en la pestaña Editor de métodos.
Para el experimento inicial, cree un gradiente lineal de sal o pH, mientras que para el método optimizado cree un degradado más específico o un programa escalonado según el manuscrito. Incluya una señal de pulso en el método que desencadenará la recopilación de datos en el software MALS. A continuación, abra la válvula de la bomba y lave con hidróxido de sodio de 0,5 molares para eliminar las impurezas fuertemente unidas, seguido de un lavado tampón de neutralización.
A continuación, lave la columna con el pH de tampón Tris ocho, la válvula A con tampón de lavado y la válvula B con tampón de elución. Utilice el tampón de lavado con la baja concentración de sal como lavado final para enjuagar la columna, para permitir la unión de la proteína a la matriz de columna. Antes de la inyección de la muestra, después del lavado, y al final de la elución, la línea de base de dispersión de la luz debe estabilizarse para garantizar un bajo nivel de ruido y una dilución completamente pura.
Con una jeringa, coloque la muestra de proteína en el bucle. Inicie el experimento primero en el software MALS haciendo clic en el botón Ejecutar y, a continuación, en el software FPLC. Los datos se recopilarán después de recibir la señal de pulso del instrumento FPLC a través del detector MALS.
Si el MALS de intercambio iónico se realiza manualmente con un modo de flujo continuo en lugar de un método independiente, aplique los mismos parámetros de la ejecución e instrucciones como se describió anteriormente. Una vez que se ha verificado y ejecutado el método final, realice exactamente el mismo método utilizando una inyección en blanco cargando el búfer en lugar de la muestra. Es importante que la sincronización entre el pulso de auto-inyección y el gradiente de la ejecución en blanco sea idéntica a la de la ejecución de la muestra.
Para comenzar el análisis, en la sección Procedimientos del software MALS, utilice la pestaña Despiking y el nivel Normal para suavizar los cromatogramas. Si exhiben mucho ruido, establezca el nivel en Heavy. En la vista Línea base, defina la línea base para todas las señales, incluidos los detectores LS, UV y RI.
En la vista Picos, defina los picos para el análisis. Verifique los valores correctos del valor de incremento de RI dn/dc y el coeficiente de extinción UV para la proteína debajo de cada pico. En la vista Masa molar y Radio de dispersión de luz, analice la masa molar y el radio utilizando el modelo Zimm y ajuste el grado de cero.
Si QELS está disponible, en la vista Rh de QUELS, observe los valores Rh y la calidad de ajuste de la función de correlación. La señal RI cambia significativamente durante la ejecución de MALS de intercambio iónico debido al aumento de la concentración de sal. Para restar la señal de línea base de la inyección en blanco, abra los experimentos MALS de intercambio iónico de proteínas y en blanco.
Haga clic con el botón derecho en el nombre del experimento proteico, seleccione Aplicar método y elija la carpeta Resta de línea base en el cuadro de diálogo del archivo. Seleccione el método en línea para el análisis de masa molar estándar. En la vista Resta de línea base, haga clic en Importar en blanco para importar las señales de la ejecución en blanco.
En Instrumentos, compruebe todos los detectores que desea restar. Para calibrar el sistema MALS de intercambio iónico con monómero BSA, en la vista Procedimientos y configuración, alinee los picos. En la vista Normalización, escriba 3,0 nanómetros como valor Rg para realizar la normalización.
Entonces, bajo la ampliación de la banda en la misma lengueta de la configuración, elija el pico y utilice el botón Del ajuste del rendimiento para hacer juego las señales UV y LS a la señal RI. El gráfico de los resultados se muestra en la vista Ajuste de resultados. Cambie las escalas del eje y otros parámetros del gráfico haciendo clic con el botón derecho en el gráfico, seleccionando Editar y, a continuación, haciendo clic en el botón Avanzado.
Para tener más opciones de visualización, seleccione la pestaña Gráfico EASI y, en la parte superior de la ventana del menú desplegable Mostrar, seleccione Misa molar o Resultados de Rh Q.Todos los resultados, incluida la masa molar, el radio, el nivel de pureza y otros están disponibles en la vista Informe en la sección Resultados. Utilice el botón Diseñador de informes para agregar más resultados o parámetros, así como cifras, al informe. En este experimento, BSA se analizó en MALS de intercambio iónico utilizando una columna analítica de intercambio de aniones.
Los cromatogramas mostraban los rayos UV a 280 nanómetros, la dispersión de la luz en un ángulo de 90 grados, el índice de refracción y las curvas de conductividad junto con la masa molar de cada pico. Un gradiente lineal ancho que consta de 30 volúmenes de columna de 75 mililitros a 350 mililitros de cloruro sódico separados monómeros BSA de dimers y oligómeros más altos. El análisis de MALS aguas abajo dio como resultado una masa molar monómero calculada de 66,8 kilodaltones y una masa molar de dimer calculada de 130 kilodaltones.
Basado en la conductividad tampón en los picos eluidos, el gradiente se cambió a un programa diferente, un paso largo de cloruro de sodio de 175 mililitrolar, seguido de un gradiente lineal de cloruro de sodio de 175 mililitrolares a 500 mililitrolares. El nuevo gradiente mejoró en gran medida la resolución y produjo una excelente separación entre el monómero BSA y las especies oligoméricas más altas. Se aplicó un programa escalonado de cloruro de sodio de 200 mililitrolares y 250 mililitrolares para centrarse también en las especies oligoméricas altas.
Esto dio lugar a una excelente separación entre el monómero BSA, el dimer y el recortador. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como la espectrometría de masas, la actividad SDS-PAGE y las pruebas de estabilidad en cada variante separada por intercambio iónico para identificar y caracterizar aún más cada una de ellas. Encontramos que el intercambio iónico MALS extiende la potencia del análisis MALS a muestras que no pueden ser analizadas completamente por SEC-MALS.
La separación por cargo resuelve especies distintas que se coelute en sec.
