Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine

Questo protocollo presenta i MAL a scambio ionico, un nuovo metodo per il controllo e la caratterizzazione della qualità delle proteine, il controllo di qualità che è essenziale per la coerenza e l'integrità dei risultati nella ricerca sulle scienze della vita e nello sviluppo di prodotti farmaceutici. Il MALS a scambio ionico determina la purezza delle proteine, lo stato oligomerico, l'omogeneità, l'identità, la conformazione, la struttura, le modifiche post-traslazione e altre proprietà. Le misurazioni non sono distruttive e vengono effettuate in soluzione in condizioni tampone quasi fisiologiche.

Questo metodo determina con precisione la massa molare di proteine o peptidi, lo stato oligomerico e il grado di coniugazione, ad esempio le glicoproteine. Può anche essere applicato alle proteine di membrana. IEX separa le macromolecole dalla loro carica superficiale.

Lo scambio di anion, AIEX e lo scambio di cationi, CIEX, le matrici si legano rispettivamente in modo negativo e positivo. Con una netta separazione tra popolazioni proteiche che condividono una massa o una forma relativamente vicina, IEX-MALS determina con successo la massa molare di ogni singolo stato proteico in un campione di miscela. Per iniziare, utilizzare un filtro da 0,1 micrometri per filtrare tutti i reagenti, inclusi i tamponi di lavaggio ed eluizione.

Filtrare i primi da 50 a 100 millilitri di tampone in una bottiglia di scarto per eliminare il particolato dai filtri a secco. In una bottiglia pulita e sterile che è stata lavata accuratamente con acqua filtrata e tamponata per evitare che la polvere entri, filtrare il resto del tampone. Con pH-otto Tris buffer e cloruro di sodio 50 millimolare, diluire un campione di BSA a sei milligrammi per millilitro in modo che il pH e la forza ionica consentano il legame alla colonna di scambio ionico.

Utilizzare una siringa per iniettare almeno da 0,3 a 0,5 milligrammi di BSA in una colonna da un millilitro per ottenere un'analisi MALS di buona qualità. Per avviare un esperimento MALS a scambio ionico, aprire New, Experiment from Method nel software MALS e selezionare il metodo online dalla cartella light scattering dei metodi di sistema. Se il modulo DLS è disponibile e i dati DLS devono essere acquisiti, selezionare il metodo online dalla sottocartella Light Scattering, With QELS.

Per impostare i parametri, nella sezione Configurazione impostare innanzitutto la portata dell'esecuzione nella sezione Pompa generica sulla portata utilizzata nell'FPLC come 1,5 millilitri al minuto. Nella sezione Solvente immettere o verificare i parametri tampone. Sotto la sezione Iniettore, immettere il nome della proteina come BSA, l'incremento dell'indice di rifrazione come 0,185 millilitri per grammo e il coefficiente di estinzione UV alla lunghezza d'onda di 280 nanometri come 0,66 litri per grammo per centimetro.

Nella scheda Campione immettere la concentrazione del campione proteico come sei milligrammi per millilitro, quindi inserire il volume del campione per iniezione anche come 170 microlitri. Nella scheda Raccolta di base della sezione Procedure selezionare la casella di controllo Trigger sull'applicazione automatica e impostare la durata dell'esecuzione su 70 millilitri in modo che la raccolta dei dati venga continuata per almeno cinque minuti dopo che la sfumatura ha raggiunto il valore finale. Quindi, nel software FPLC, creare un nuovo esperimento nella scheda Editor metodi.

Per l'esperimento iniziale, creare un gradiente lineare di sale o pH, mentre per il metodo ottimizzato creare un gradiente più specifico o un programma graduale secondo il manoscritto. Includere un segnale di impulso nel metodo che attiverà la raccolta dei dati nel software MALS. Quindi, aprire la valvola della pompa e lavare con idrossido di sodio 0,5 molare per rimuovere le impurità fortemente legate, seguito da un lavaggio tampone di neutralizzazione.

Quindi, lavare la colonna con tris buffer pH otto, la valvola A con tampone di lavaggio e la valvola B con tampone di eluizione. Utilizzare il tampone di lavaggio con la bassa concentrazione di sale come lavaggio finale per risciacquare la colonna, per consentire il legame della proteina alla matrice della colonna. Prima dell'iniezione del campione, dopo il lavaggio e al termine dell'eluizione, la linea di base di dispersione della luce deve essere stabilizzata per garantire un basso rumore e una diluizione completamente pura.

Usando una siringa, posizionare il campione proteico nel ciclo. Avviare l'esperimento prima nel software MALS cliccando sul pulsante Esegui e poi nel software FPLC. I dati saranno raccolti dopo aver ricevuto il segnale di impulso dallo strumento FPLC tramite il rilevatore MALS.

Se il MALS a scambi ionici viene eseguito manualmente con una modalità di flusso continuo anziché con un metodo autonomo, applicare gli stessi parametri dell'esecuzione e le stesse istruzioni descritte in precedenza. Una volta che il metodo finale è stato verificato ed eseguito, eseguire esattamente lo stesso metodo utilizzando un'iniezione vuota caricando il buffer anziché l'esempio. È importante che la temporizzazione tra l'impulso di iniezione automatica e la sfumatura della corsa vuota sia identica a quella dell'esecuzione del campione.

Per iniziare l'analisi, nella sezione Procedure del software MALS, utilizzare la scheda Despiking e il livello Normale per smussare i cromatogrammi. Se mostrano molto rumore, imposta il livello su Pesante. Nella vista Baseline definire la linea di base per tutti i segnali, inclusi i rivelatori LS, UV e RI.

Nella vista Picchi definire i picchi per l'analisi. Verificare i valori corretti del valore di incremento RI dn/dc e del coefficiente di estinzione UV per la proteina sotto ogni picco. Sotto la vista Massa molare e Raggio dalla vista Dispersione luce, analizzate la massa molare e il raggio utilizzando il modello Zimm e il grado di adattamento pari a zero.

Se QELS è disponibile, sotto la vista Rh da QUELS, osservare i valori Rh e la qualità di adattamento della funzione di correlazione. Il segnale RI cambia significativamente durante la corsa MALS a scambio ionici a causa dell'aumento della concentrazione di sale. Per sottrarre il segnale di base dall'iniezione in bianco, aprire sia la proteina che gli esperimenti MALS a scambio ionica vuoto.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'esperimento proteico, scegliere Applica metodo e scegliere la cartella Sottrazione baseline dalla finestra di dialogo del file. Selezionare il metodo online per l'analisi standard della massa molare. Nella visualizzazione Sottrazione baseline fare clic su Importa vuoto per importare i segnali dell'esecuzione vuota.

In Strumenti controllare tutti i rilevatori da sottrarre. Per calibrare il sistema MALS a scambio ionica con monomero BSA, in visualizzazione Procedure e configurazione, allineare i picchi. Nella vista Normalizzazione immettere 3,0 nanometri come valore Rg per eseguire la normalizzazione.

Quindi, in Allargamento banda nella stessa scheda Configurazione, scegliere il picco e utilizzare il pulsante Esegui adattamento per abbinare i segnali UV e LS al segnale RI. Il grafico dei risultati viene visualizzato nella vista Raccordo risultati (Results Fitting). Modificare le scale dell'asse e altri parametri del grafico facendo clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, selezionando Modifica e quindi facendo clic sul pulsante Avanzate.

Per avere più opzioni di visualizzazione, selezionate la scheda Grafico EASI e nella parte superiore della finestra del menu a discesa Visualizza (Display), selezionate Massa molare (Molar Mass) o Rh Q.Tutti i risultati (Rh Q.All), inclusi massa molare, raggio, livello di purezza e altri, sono disponibili nella vista Report nella sezione Risultati. Utilizzare il pulsante Progettazione report per aggiungere altri risultati o parametri, nonché figure, al report. In questo esperimento, la BSA è stata analizzata su MALS a scambio ionici usando una colonna analitica di scambio ionici.

I cromatogrammi mostravano l'UV a 280 nanometri, la diffusione della luce ad un angolo di 90 gradi, l'indice di rifrazione e le curve di conducibilità insieme alla massa molare di ogni picco. Un ampio gradiente lineare costituito da 30 volumi di colonna da 75 millimolare a cloruro di sodio 350 millimolare separava i monomeri BSA dai dimeri e dagli oligomeri più alti. L'analisi MALS a valle ha portato ad una massa molare monomero calcolata di 66,8 kilodalton e ad una massa molare dimero calcolata di 130 kilodalton.

Basato sulla conducibilità tampone ai picchi elusi, il gradiente è stato cambiato in un programma diverso, un lungo passo di cloruro di sodio 175 millimolare, seguito da un gradiente lineare da 175 millimolare a 500 millimolare cloruro di sodio. Il nuovo gradiente migliorò notevolmente la risoluzione e produsse un'eccellente separazione tra monomero BSA e specie oligomeriche superiori. Un programma graduale di cloruro di sodio da 200 millimolare e 250 millimolare è stato applicato per concentrarsi anche sulle specie ad alto oligomerico.

Ha portato ad un'eccellente separazione tra monomero BSA, dimero e trimer. Seguendo questa procedura, metodi come la spettrometria di massa, l'attività SDS-PAGE e i test di stabilità possono essere eseguiti su ogni variante separata dallo scambio ionica per identificare e caratterizzare ulteriormente ciascuno di essi. Abbiamo scoperto che mals a scambio ionica estende la potenza dell'analisi MALS a campioni che non possono essere completamente analizzati da SEC-MALS.

La separazione per carica risolve specie distinte che coelevano in SEC.