La microscopía DIC es superior al campo oscuro en nanopartículas plasmónicas de imagen en entornos complejos. Sin embargo, DIC también requiere un mayor conocimiento y habilidad para obtener resultados reproducibles. La microscopía DIC proporciona alta resolución lateral y poca profundidad de campo.
Ambos rasgos son extremadamente importantes al monitorear nanopartículas dentro de las células o en entornos complejos. Para comenzar, utilice un lápiz garabato para colocar una marca de arañazos poco profunda y corta en el centro de cada tapa de vidrio y, a continuación, limpie el vidrio como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar 100 microlitros de una solución de nanopartícula de oro de 05 miligramos por mililitro de su contenedor de almacenamiento original, y expulse la solución en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 6.000 veces la gravedad. Cuando haya terminado, retire el sobrenadante con una micropipeta para eliminar el exceso de surfactante de la solución de nanopartículas. A continuación, añada 100 microlitros de agua ultrapura al tubo centrífugo.
Vórtice brevemente la muestra para romper el pellet, y luego sonicarla durante 20 minutos inmediatamente después para resuspender completamente los agregados de nanopartículas. Usando una micropipeta, lanzar seis microlitros de solución de nanopartículas en el cubreobjetos de vidrio limpio y rayado. A continuación, voltee cuidadosamente el cubreobjetos y colóquelo encima de una segunda pieza más grande de vidrio del microscopio.
La gota debe extenderse rápidamente uniformemente entre los dos trozos de vidrio. Tenga cuidado de evitar que las burbujas de aire queden atrapadas entre los dos trozos de vidrio. Utilice una línea estrecha de esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos para evitar la evaporación del líquido.
Coloque la muestra en la etapa del microscopio y alinee el objetivo y el condensador del microscopio. Ajuste el enfoque para encontrar el plano focal con la muestra y localice la marca de rayado creada anteriormente. Concéntrese en él y ajuste el enfoque hasta que las nanopartículas se vean.
Para determinar la colocación precisa del condensador, utilice el método de iluminación Kohler comenzando con el objetivo 20x y luego pasando a aumentos altos como 80 o 100x. A continuación, seleccione una región de interés dentro de la muestra para obtener imágenes. Centre la región en el campo de visión de la cámara y ajuste el enfoque según sea necesario.
Si el microscopio tiene el diseño de Senarmont, comience con el polarizador establecido cerca de la máxima extinción de fondo y gire gradualmente el polarizador hacia la disminución de la extinción de fondo. La intensidad del fondo aumentará gradualmente. El entorno ideal se logra cuando las nanopartículas alcanzan su mayor diferencia de intensidad en comparación con la media de fondo local.
Para las nanopartículas plasmónicas, el mayor contraste se logra típicamente con un fondo relativamente oscuro en o cerca de la extinción de fondo máxima. Apague la iluminación de la habitación para evitar que la iluminación perdida interactúe con el proceso. Poner en su lugar un ancho completo de 10 nanómetros a medio máximo de filtro de paso de banda con su longitud de onda central co-ubicada con la longitud de onda de resonancia de plasmon de superficie localizada principal con el fin de ver la región de interés.
A continuación, ajuste la intensidad o el tiempo de exposición de la lámpara hasta que el nivel de fondo esté en el 5% al 40% del nivel de capacidad máxima de la cámara. Ningún objeto dentro de la región de interés debe exhibir intensidades de señal que excedan el 90% del nivel de intensidad máxima de la cámara. I imagen de la muestra con una serie de filtros de paso de banda que cada uno tiene un ancho completo a medio-máximo de 10 nanómetros, y que en su conjunto permiten la creación de imágenes en todo el rango de longitud de onda de interés.
Asegúrese de que la intensidad de fondo en las imágenes se mantenga dentro del 5% de la una de la otra ajustando el tiempo de exposición y no la potencia de la lámpara. Después de cambiar de filtro, vuelva a enfocar la muestra antes de capturar imágenes. Guarde las imágenes como archivos TIFF sin comprimir y/o en el formato de archivo nativo del software para conservar toda la información relevante.
Para comenzar el análisis, abra la imagen con ImageJ. Utilice la herramienta rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de la región principal de interés. A continuación, en la barra de herramientas, seleccione la imagen, vaya al zoom y seleccione la selección.
La ventana de imágenes ampliará el área seleccionada. A continuación, seleccione la imagen, vaya a ajustar y seleccione brillo/contraste. Para mejorar la vista de la región de muestra, ajuste el mínimo, el máximo, el brillo y el contraste de la imagen.
Estos ajustes no alteran los datos científicos, sino que simplemente permiten una mejor visibilidad de la región de la muestra. Ahora, utilice la herramienta rectángulo de nuevo y dibuje un cuadro alrededor de la primera nanopartícula que se va a medir. La caja debe ser sólo un poco más grande que el disco ventilado de la nanopartícula.
Una vez seleccionado, vaya a analizar y seleccione medir. Aparece una nueva ventana que informa de las intensidades mínimas, máximas y medias de los píxeles situados dentro del cuadro seleccionado. Conservando el tamaño original del cuadro, arrastre el cuadro a un área inmediatamente adyacente a la partícula donde el contraste de fondo es relativamente uniforme y no hay partículas ni contaminantes presentes.
Utilice de nuevo la herramienta de medida para determinar la intensidad media del área de fondo. Repita este proceso para cada partícula en todas las imágenes de la serie. A continuación, exporte los datos a una hoja de cálculo para calcular el contraste o la intensidad de cada partícula en todas las longitudes de onda y ángulos.
Introduzca la siguiente ecuación para calcular el contraste de cada partícula. Por último, grafica el perfil espectral en una posición de nanopartícula determinada trazando datos con la longitud de onda a lo largo del eje X y el contraste o intensidad a lo largo del eje Y. Para determinar el ajuste óptimo de la imagen, estas nanoesferas de oro fueron imágenes en varios ajustes del polarizador.
En cero grados, las partículas aparecen en su mayoría blancas con una franja oscura que corre a través de su sección media. Esto es indicativo de polarización cruzada para muestras de nanoesfera. Cuando el polarizador se gira a diferentes ángulos, las partículas proyectan sombras oscuras hacia una esquina.
Sin embargo, los valores de contraste de partículas cambian drásticamente. Para esta muestra, el ajuste de imagen óptimo es con un desplazamiento polarizador de 10 grados. Aquí la longitud de onda se traza contra el contraste de las nanoesferas de oro.
Cada punto de datos representa un promedio de 20 nanoesferas para cada diámetro de partícula. El contraste máximo de cada partícula cambia ligeramente dependiendo de su tamaño. La intensidad y rotación es aún más importante con formas anisotrópicas como esta nanorod de oro.
Aquí la longitud de onda se traza contra la intensidad en dos configuraciones de polarizador diferentes. En cada caso, la intensidad del lado brillante es mucho más fuerte que la del lado oscuro. El perfil de intensidad de una sola nanorod de oro en su longitud de onda de resonancia de plasmón de superficie localizada durante la rotación de la etapa muestra una gran diferencia de intensidad entre los lados oscuros y brillantes a medida que la muestra gira a través de 180 grados.
La toma de imágenes de muestras es extremadamente importante. Requiere diligencia y paciencia por parte del microscopista. Si está realizando un experimento que requiere reinventar la muestra durante una serie de días, los puntos de referencia, como las marcas de arañazos, son fundamentales para reubicar la región de interés.
La microscopía DIC está creciendo en interés por los investigadores que estudian nanopartículas, especialmente en entornos dinámicos y celulares. Porque DIC ofrece una resolución espacial óptima, especialmente en entornos de muestreo complejos.
