El protocolo aquí descrito permite la generación aleatoria de bibliotecas de ARN de longitud completa mutagenizadas aleatoriamente de genomas virales de ARN de cadena única de hasta 10 kilobytes de longitud, y la selección de fenotipos de interés en las condiciones experimentales deseadas. Esta técnica puede crear bibliotecas de ARN viral de longitud completa con diferentes niveles de diversidad genética en poco tiempo utilizando un enfoque libre de clonación. La técnica utiliza reactivos baratos y ampliamente disponibles para la síntesis de bibliotecas.
Shaheen Khan, estudiante de doctorado de la Sección de Virología del Departamento de Ciencias de la Vida de la Universidad Shiv Nadar, demostrará el procedimiento. Para comenzar, realice ep-PCR preparando la mezcla maestra para cuatro conjuntos de experimentos con cebadores directos e inversos junto con los componentes de reacción sin la plantilla pJFH1, como se describe en el manuscrito de texto. Alícuota de la mezcla maestra en cuatro tubos.
Agregue 100 nanogramos, 50 nanogramos, 25 nanogramos y 10 nanogramos de la plantilla en los tubos individuales y ajuste el volumen total de la reacción a 50 microlitros. Aplique las condiciones cíclicas para amplificar un fragmento de par de 36 bases 97. Estime el producto de ep-PCR amplificado cargando cinco microlitros de los productos de PCR y comparándolo con cantidades conocidas de una escalera de ADN de kilobase mediante la ejecución de una electroforesis en gel de agarosa basada en TAE al 0,8%.
Purifique el producto con un kit de purificación en columna. Estime la concentración del producto purificado midiendo la absorbancia a 260 nanómetros. Concentrar al vacío el producto ep-PCR para obtener una concentración de producto igual o superior a 100 nanogramos por microlitro.
Configure una reacción de síntesis de ARN in vitro y colóquela a 37 grados centígrados para la incubación. A continuación, purifique el producto sintetizado utilizando un kit de purificación en columna. Configure una reacción de síntesis de ADNc de 20 microlitros agregando aproximadamente un microgramo del ARN viral, cinco cebadores inversos micromolares y 200 unidades de transcriptasa inversa, según las recomendaciones del fabricante.
Usando el ADNc, prepare una mezcla de reacción como se describe en el manuscrito del texto y ejecute un ciclo de amplificación. Ejecute el producto en un gel de agarosa a base de TAE al 0,8 % para confirmar el tamaño del producto de 25 pares de 71 bases y, a continuación, purifique el producto con un kit de purificación en columna como se demostró anteriormente. Eluir en 40 microlitros de agua estéril.
Para añadir un voladizo de tres primos A, añada 0,5 micromolares de DATP y una unidad de ADN polimerasa Taq de baja fidelidad, e incube todo el producto de PCR a 70 grados centígrados durante 30 minutos, junto con 1X tampón de PCR y 1,5 milimolares de cloruro de magnesio. A continuación, purifique la mezcla con un kit de purificación en columna. Configure la reacción de ligadura e incube a temperatura ambiente durante tres horas.
A continuación, añada 100 microlitros de Escherichia coli DH5-Alpha al ADN ligado y realice un choque térmico en las células a 42 grados centígrados durante 35 segundos. Agregue un mililitro de medio LB a la suspensión celular e incube agitando suavemente durante una hora a 37 grados centígrados. Centrífuga a 13, 800 RCF.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 200 microlitros de medio LB fresco. Coloque 100 microlitros de las células transformadas de E. coli DH5-Alpha en una placa LB que contenga 50 microgramos por mililitro de ampicilina e incube a 37 grados centígrados durante 16 horas. Configure mini preparaciones de 25 a 30 colonias en cinco mililitros de medio LB que contengan 50 microgramos por mililitro de ampicilina y crezca durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, extraer los plásmidos con un kit comercial y realizar la digestión enzimática de restricción en un volumen de 10 microlitros con 200 nanogramos de los plásmidos aislados, dos unidades de EcoR1 y un tampón de restricción 1X para todas las colonias. Después de incubar las mezclas de digestión a 37 grados centígrados durante tres horas, cargue los productos en gel de agarosa a base de TAE al 0,8% para confirmar la inserción del ADN plasmídico. Realizar la secuenciación Sanger de los plásmidos de 25 clones positivos utilizando los cebadores recomendados.
Un día antes de la transfección, divida las células y cuente el número de células viables con un hemocitómetro. A continuación, siembre las células de hepatoma humano 7,5 en placas de 35 milímetros en dos mililitros de DMEM completo, e incube las células a 37 grados centígrados durante 16 horas en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, prepare el complejo lipídico de transcripción diluyendo 10 microlitros de reactivo de transfección en 50 microlitros del medio esencial mínimo y diluya por separado cinco microgramos de transcritos virales en 50 microlitros del medio esencial mínimo.
Incubar ambas mezclas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego mézclalos en un solo tubo de microcentrífuga estéril e incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación celular, retire el medio de cultivo, lave las células dos veces con PBS 1X precalentado y agregue 1,5 mililitros del medio esencial mínimo.
Agregue lentamente el complejo y agite suavemente el plato para una distribución uniforme. Incubar las células a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 10 horas. A continuación, retire el medio.
Lave las células transfectadas dos veces con un mililitro de PBS 1X precalentado y agregue dos mililitros de DMEM completo. Aísle ARN viral de 140 microlitros de sobrenadantes de cultivo utilizando un kit de aislamiento de ARN viral. Configure una reacción qRT-PCR de 10 microlitros utilizando un kit comercial de qRT-PCR.
Utilice los cebadores directos e inversos y la sonda para la cuantificación del ARN del VHC. Ajuste el ciclo de reacción a 48 grados Celsius durante 20 minutos, 95 grados Celsius durante 10 minutos, 45 ciclos de 95 grados Celsius durante 15 segundos y 60 grados Celsius durante un minuto. Ejecute las reacciones y configure controles negativos.
Paralelamente, genere una curva estándar utilizando un número de copias conocidas diez veces diluido en serie de transcripciones del VHC para cuantificar el ARN viral. Realizar por triplicado. Coloque 7,5 células de hepatoma humano en una placa de 96 pocillos e incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5% aproximadamente 16 horas antes de agregar el virus.
En un gabinete de bioseguridad de Clase II, realice diluciones en serie diez veces mayores del virus. Agregue 100 microlitros del virus diluido por pocillo para infectar las células e incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de tres días, lavar las células infectadas tres veces con 0,1 mililitros de PBS, y fijar y permeabilizar las células con 0,1 mililitros de metanol helado a menos 20 grados centígrados durante 20 minutos.
Lave los pocillos con 1X PBS tres veces y luego 1X con PBST. Después de retirar el PBST, bloquee las células durante 30 minutos a temperatura ambiente con 0,1 mililitros de BSA al 1 % que contengan 0,2 % de leche desnatada en PBST. Retire la solución de bloqueo y trate las células durante cinco minutos con 0,1 mililitros de peróxido de hidrógeno al 3% preparado en 1X PBS.
Nuevamente, lave las celdas dos veces con 1X PBS y 1X con PBST. Agregue 50 microlitros de anticuerpo monoclonal anti-NS5A 9E10 por pocillo e incube a temperatura ambiente durante una hora. Lave los pocillos tres veces con 1X PBS y una vez con PBST.
Agregue 50 microlitros de IgG secundaria anti-ratón de cabra conjugada HRP por pocillo, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego elimine el anticuerpo no unido lavando los pocillos con 0,1 mililitros de PBS 1X. Agregue 30 microlitros de DAB e incube la placa con un suave balanceo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución DAB y lave los pocillos dos veces con 1X PBS y una vez con agua destilada.
Añadir 100 microlitros de PBS que contengan azida sódica al 0,03%. Examine cada pocillo bajo un microscopio de luz invertida con un objetivo 10X. Cuente el número de pozos positivos.
Utilice una calculadora de Reed y Muench para estimar la dilución del punto final que infecta el 50% de los pocillos. Disolver pibrentasvir, un inhibidor de NS5A, en DMSO al 100% a una concentración de un milimolar y diluirlo en DMEM completo a una concentración de 10 nanomolares. A continuación, infecte las células Huh-7.5 vírgenes al 70% de confluencia con una dosis del virus ML50 para infectar el 50% de las células durante 12 horas, y luego transfiera las células infectadas a placas de seis pocillos 24 horas después de la infección.
Agregue 1X EC50 PIB a las células infectadas después de 16 horas de división celular. Haga esto después de cada célula dividida durante seis pases consecutivos, seguidos de tres ciclos de pasaje sin fármacos, y controle la propagación del virus mediante un ensayo de formación de foco. Coseche los sobrenadantes virales en cada pasaje y guárdelos a menos 80 grados centígrados.
Extraiga el ARN viral del sobrenadante en el día 18 y el ADNc sintetizado. Amplificar el gen NS5A utilizando cinco microlitros de ADNc diluido. A continuación, determine las mutaciones de resistencia a los fármacos NS5A en seis a ocho plásmidos bacterianos positivos utilizando los cebadores de secuenciación NS5A.
Las bibliotecas de mutantes del genoma completo se sintetizaron utilizando pJFH1 clonal en cantidades decrecientes de 100 a 10 nanogramos. Los rendimientos medios de los productos ep-PCR oscilaron entre 3,8 y 12,5 nanogramos por microlitro. La proporción de mutaciones en las bibliotecas de mutantes aumentó con la disminución de la entrada de pJFH1 en la reacción ep-PCR.
El ML50 sintetizado con 50 nanogramos de la plantilla tenía cuatro sustituciones por cada 10.000 pares de bases copiados, mientras que el ML25 sintetizado con 25 nanogramos de plantilla albergaba nueve sustituciones. No se encontraron sustituciones en el número de nucleótidos secuenciados en el clon pJFH1. Las variantes virales ML50 fueron menos susceptibles al pibrentasvir en comparación con el virus clonal JFH1.
De los ocho clones de NS5A, cuatro tenían una combinación de D7V + F28C, mientras que V8A + F28C y F36L ocurrieron en un clon cada uno. Estas mutaciones se encontraban en la región del extremo N de NS5A, que se sabe que alberga mutaciones de resistencia a NS5A clínicamente relevantes. La concentración final de cada componente de ep-PCR es crítica, especialmente la cantidad de plantilla.
La falta de KB Extender reducirá en gran medida el rendimiento del producto ep-PCR.
