La síntesis de proteínas es propensa a errores. Sin embargo, los errores pueden ser adaptativos bajo estrés fisiológico. Hemos demostrado anteriormente que los errores de traducción específicos en el micobacterium contribuyen a la tolerancia a los antibióticos.
Ser capaces de medir tasas de error específicas nos permite apuntar a este mecanismo de adaptación a bacterias. Las principales ventajas de estas técnicas son que los reporteros de ganancia de función pueden ser exquisitamente sensibles en la medición de pequeñas tasas de error que no son fáciles de detectar por espectrometría de masas. El ensayo Nluc/GFP permite el cribado de rendimiento medio, ya que evita el manejo excesivo y la lysis de las bacterias.
Demostrando el procedimiento será el estudiante de doctorado Yue-Meng Chen. Hoy vamos a demostrar el procedimiento de uso de estos dos reporteros a través de este video. Para empezar, inocular dos mililitros de 7H9 medio con cepas de reporteros micobacterianas mutadas y mutadas.
Agitar a 37 grados Centígrados durante uno o dos días o hasta que el OD a 600 nanómetros alcance la fase estacionaria. Aliquot y diluir para obtener una OD a 600 nanómetros alrededor de 0.5 a 1. A continuación, añadir ATC a una concentración final de 50 nanogramos por mililitro.
Añadir inmediatamente diferentes dosis de ksg a la cultura de acuerdo con el manuscrito para medir sus efectos sobre las tasas de traducción incorrecta. Incubar a 37 grados centígrados con temblores durante cuatro a seis horas. A continuación, transfiera los cultivos bacterianos a un tubo de dos mililitros.
Y centrifugar a 3,220 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos para reducir las bacterias. Después del paso de centrifugación, deseche el sobrenadante y interrumpa las bacterias añadiendo 40 microlitros de 1x tampón de lisis pasiva. Transfiera el izado bacteriano resuspendido a una placa blanca de 96 pozos, un pozo por muestra, y agite a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Añadir 80 microlitros de sustrato de luciérn derecho a la chimenea a cada pozo. Agitar durante 15 segundos y medir la luminiscencia por un luminómetro. A continuación, añadir 80 microlitros de sustrato de Renilla a cada pozo.
Agitar durante 15 segundos y medir la luminiscencia por el luminómetro. Utilice los valores corregidos para calcular las tasas de traducción incorrecta de cada condición. Para empezar, inocular dos mililitros de 7H9 medio con la cepa bacteriana reportero.
Agitar a 37 grados Centígrados durante uno o dos días o hasta que el OD a 600 nanómetros alcance la fase estacionaria. Luego, la subcultura en 50 mililitros de 7H9 medio y crecer hasta que la OD a 600 nanómetros alcanza la fase estacionaria tardía. Antes de alícuotar las bacterias a una placa de 96 pozos, añadir ATC a una concentración final de 50 nanogramos por mililitro y mezclar bien.
Agregue 100 microlitros por pozo a una placa clara de 96 pozos de fondo redondo. A continuación, añadir diferentes dosis de ksg a pozos seleccionados para examinar sus efectos sobre las tasas de traducción incorrecta. Agregue 200 microlitros de agua estéril a los pozos de borde de la placa para limitar la evaporación de los pozos de muestra.
Selle la placa, agite e induzca las muestras a 37 grados centígrados durante 16 a 20 horas. Utilice una pipeta multicanal para tomar 80 microlitros de cada pozo. Transfiera las muestras a una placa de 96 pozos con fondo negro y mida la señal GFP por el luminómetro.
Después de medir la señal GFP, centrifugar la placa a 3, 220 veces g durante 10 minutos. A continuación, transfiera 50 microlitros del sobrenadante a una placa de 96 pozos de fondo blanco. A continuación, agregue 50 microlitros de sustrato De Nluc a cada pozo.
Mezclar bien y medir la luminiscencia por el luminómetro. Por último, determine la relación Nluc/GFP dividiendo el valor de luminiscencia Nluc corregido por fluorescencia GFP. En este trabajo, el sistema de reporteros de moscas de fuego Renilla se utilizó para medir la tasa de traducción incorrecta en presencia de kasugamicina en tipo salvaje y en una cepa de S.Smegmatis que ksgA fue eliminada.
Los resultados mostraron una forma clara dependiente de la dosis de ksg disminuyendo la tasa de traducción incorrecta, mientras que en la cepa de eliminación de ksgA, ksg era menos potente y la línea de base de la tasa de traducción incorrecta fue mayor debido a la resistencia a la modulación por kasugamicina. La acción de Kasugamicina sobre la traducción incorrecta también se midió utilizando el reportero de Nluc/GFP. Tanto Renilla fogata como reportero de Nluc/GFP implican medir la actividad de luciferasa.
Los pequeños errores de pipeteo podrían causar grandes fluctuaciones en las lecturas. Para empezar, sugerimos aumentar el número de cada réplica para minimizar la posibilidad de obtener lecturas poco fiables.
