Este ensayo molecular de tuberculosis, responde tres preguntas clave. Uno:¿Cuál es la magnitud de la carga de enfermedad del paciente? Dos:¿Cómo responde la carga de morbilidad del paciente al medicamento contra la tuberculosis?
Y tres:¿Cuál es la relación entre la carga de morbilidad y la respuesta al tratamiento? Este ensayo produce un resultado cuantitativo de la carga de tuberculosis del paciente, y mide cómo esta carga cambia con el tratamiento en poco tiempo. Con la modificación, esta metodología se puede aplicar a otros patógenos bacterianos.
Ya hemos desarrollado tecnología similar para el diagnóstico de micobacterias notuberes, y bacterias asociadas con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Al realizar esta técnica por primera vez, vea el vídeo y practique los pasos. Es muy importante practicar con muestras que no son necesarias para los resultados de diagnóstico del paciente.
La demostración visual es fundamental porque simplifica el aprendizaje y el dominio de los pasos, especialmente aquellas partes del método que son difíciles de explicar en el texto. Comience preparando los cultivos celulares. En un banco de laboratorio limpio o cabina de clase uno, coselice alícuotas de un mililitro de fase exponencial Bacille Calmette-Guerin o cultivo BCG en tubos de plástico de 15 mililitros y ciérrelos firmemente.
Al preparar las muestras de esputo del paciente, trabaje en un espacio bien ventilado y siga las pautas del manual GL One Stop TB. Abra cuidadosamente la copa de la muestra y la pipeta alícuotas de un mililitro en tubos de centrífuga de plástico de 15 mililitros. Luego, cierre bien los tubos.
Transfiera los tubos de muestra a un estante de sujeción sumergido en un baño de agua precalentado a 95 grados centígrados, asegurándose de que 3/4 de cada tubo esté sumergido. Hervir las muestras durante 20 minutos. A continuación, transfiera los tubos al banco para enfriar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Realice la extracción de ARN en una campana de humo si utiliza un kit con cloroformo fenol o etanol capital tumoral. El procedimiento de ARN ilustrado aquí es el procedimiento de extracción de cloroformo fenol. Sin embargo, también se pueden utilizar métodos alternativos para la extracción de ARN.
Transfiera una mililitro alícuotas de la muestra inactivada por calor a tubos de 1,5 mililitros y pico 100 microlitros de control de extracción en cada muestra. Cierre los tubos y mezcle invirtiendo tres veces. Centrifugar los tubos a 20.000 g durante 10 minutos.
Luego, aspirar el sobrenadante, dejando 50 microlitros de sedimentos. Suspendemos el sedimento en 950 microlitros de tampón de lysis pipeteando y transferimos toda la suspensión a los tubos de matriz de la serie suministrados con el kit de extracción de ARN. Cierre bien los tubos y asegúrese de que estén etiquetados tanto en la tapa como en el lateral.
A continuación, homogeneizar las muestras durante 40 segundos a 6.000 rpm. Centrifugar el izado a 12.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare tubos frescos de un mililitro y agregue 300 microlitros de cloroformo.
Utilice una pipeta de un mililitro para aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin tocar la matriz de lesificación y transferirlo al tubo con el cloroformo. Vórtice los tubos durante cinco segundos y déjelos reposar durante cinco minutos o hasta que tres fases sean claramente visibles. Centrifugar los tubos a 12.000 g durante cinco minutos.
A continuación, pipetee cuidadosamente la fase superior y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 500 microlitros de hielo frío 100%etanol a la muestra, cerrar el tubo e invertirlo tres veces para mezclar. Incubar los tubos a menos 80 grados centígrados durante 15 minutos o a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, cargue los tubos en una micro centrífuga pre-enfriada y centrífuga durante 20 minutos a 13.000 veces g y cuatro grados Celsius. Desechar el sobrenadante, añadir 500 microlitros de 70% de etanol frío y centrífuga durante otros 10 minutos a 13.000 veces g. Deseche todo el sobrenadante.
E incubar los tubos a 50 grados Celsius durante 20 minutos para secar el pellet de ácido nucleico, asegurándose de mantener los tubos parcialmente abiertos para permitir la evaporación del etanol. A continuación, añadir 100 microlitros de agua libre de núcleo al pellet e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Vórtice la muestra durante tres segundos y proceder con la eliminación de ADN o almacenarla a menos 80 grados Celsius hasta que esté lista para usar.
El ADN preparado es una mezcla de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y pipeta 11 microlitros en cada tubo que contiene extracto de ARN. Vórtice durante tres segundos y gire brevemente hacia abajo para eliminar cualquier gota de la pared del tubo. Luego, incuba el tubo a 37 grados Celsius durante 30 minutos en el bloque caliente o incubadora.
Después de la incubación, añadir un microlitro adicional de una enzima de ADN directamente al tubo, y mezclar bien por vórtice. Luego, incuba los tubos durante otros 30 minutos a 37 grados celsius. Descongelar y vórtice el reactivo de inactivación del ADN.
A continuación, agregue 10 microlitros a cada extracto de ARN. E incubar los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Vórtice los tubos tres veces durante el paso de incubación.
Luego, centrifuga la mezcla a 13.000 veces g durante dos minutos y transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo libre de ARN de 1,5 mililitros, asegurándose de no tocar ninguna de las matrices de inactivación. Diluir todas las muestras de ARN desconocidas de uno a 10 en el agua libre del ARN, mezclarlas vórtices durante cinco segundos y girarlas brevemente hacia abajo. Descongelar muestras de MTB y EC-RNA y hacer siete y seis diluciones por diez, respectivamente, para una curva estándar.
Prepare las mezclas maestras RT plus y RT menos PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Vortex el RT plus mezclar y transferir 16 microlitros en cada RT más tubo PCR. A continuación, vórtice el RT menos mezclar y añadir 16 microlitros en cada RT menos tubo PCR.
Añadir cuatro microlitros de extracto de ARN o agua y duplicar a los tubos RT más. El agua es el control sin plantilla o NTC. Añadir cuatro microlitros de extracto de ARN o agua a los tubos RT menos.
Cargue los tubos de reacción en la máquina PCR en tiempo real, programe la reacción como se describe en el manuscrito y ejecute la reacción. Para interpretar la respuesta del tratamiento, utilice la curva estándar para convertir los valores de CQ en carga bacteriana y calcule la respuesta como el cambio en la carga bacteriana durante el período de seguimiento del tratamiento. La caída de la carga bacteriana después del tratamiento significa una respuesta positiva, mientras que ningún cambio o aumento en la carga bacteriana implica una respuesta negativa.
Para verificar que todos los bacilos M.tuberculosis estaban inactivados por calor, se midió la densidad óptica de las células y se comparó con la de las células vivas. No se observó ningún cambio en la OD a lo largo del tiempo para las muestras inactivadas por calor que indican que no hay crecimiento. Las muestras inactivadas por calor se incubaron a 37 grados centígrados para determinar si el ARN se degrada después de la inactivación del calor de las células.
No se encontró diferencia entre el ARN cosechado inmediatamente después de la inactivación del calor, y el ARN aisló uno, dos, tres y cuatro días después en ambos cultivos bcG y esputo positivo de tuberculosis. Cuando la enzima A del ARN se agregó exógenamente a las muestras, antes y después de la inactivación del calor, la pérdida de ARN ocurrió en todas las muestras inactivadas por calor a lo largo de cuatro días de incubación. El efecto de la inactivación del calor en el ARN ribosomal se midió en cultivos de BCG y esputo de pacientes con tuberculosis positiva.
La carga bacteriana medida del cultivo de control fue mayor que la carga bacteriana combinada del cultivo inactivado por calor a 80 grados celsius, 85 grados celsius y 95 grados celsius para muestras de BCG y esputo. La inactivación térmica de las muestras causa una pérdida mínima de ARN, dejando ARN adecuado para la TB-MBLA aguas abajo y otras pruebas moleculares posteriores. La Microscopía Electrónica de Transmisión se utilizó para investigar si las células son asoidadas por inactivación por calor.
La inspección de las células en aumento inferior y mayor reveló las paredes celulares intactas y los cuerpos lipídicos intracelulares visibles. Las células parecían alargadas, pero no lanchadas. Al intentar este procedimiento, es fundamental recordar agregar el control de extracción, que controla los resultados falsos negativos debido a una extracción deficiente de ARN.
Este enfoque se puede aplicar a bacterias asociadas con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, infección por micobacterias no tuberculosas y otros patógenos respiratorios. Los resultados cuantitativos de la TB-MBLA han permitido el modelado matemático y farmaco de cómo los pacientes responden a una terapia de tuberculosis. Esperamos poder aplicar la técnica en la atención de rutina donde se está gestionando a los pacientes de tuberculosis.
