Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número Premio R01HG006785.

1. Secuencia Diseño y Síntesis <ol><li> Comience MPRA con el diseño y la síntesis de secuencias a ensayar para la actividad reguladora. Para la compatibilidad con la serie de vectores pMPRA, diseñar cada secuencia utilizando la siguiente plantilla: 5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- etiqueta -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 &#39;, donde var indica la secuencia a ensayar y la etiqueta indica una o más etiquetas de identificación. </li><li> Las dos regiones variables (var) y la etiqueta están separadas por un par de KpnI (GGTACC) y XbaI (TCTAGA) sitios de restricción para facilitar la ligadura direccional de un fragmento de gen reportero entre ellos. Además, dos sitios distintos SfiI (GGCCNNNNNGGCC) se añadirán por PCR para permitir la ligación direccional en la columna vertebral pMPRA. Las regiones variables no deben contener copias adicionales de cualquiera de estos sitios de restricción. Si es necesario, uno o más de estas enzimas de restricción se pueden sustituir, Siempre y cuando las sustituciones 1) permitir un corte eficaz cerca de los extremos de moléculas de ADN, y 2) no corte en otra parte de la secuencia del vector. Ver discusión para más detalles. </li><li> Obtener los cebadores necesarios listados en la Tabla 1 de un proveedor comercial. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [índice] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Primer secuencias. [Indice] denota una secuencia de índice de 6 a 8 nt utilizado para la secuenciación de multiplexado. Obtener al menos 8 cebadores TagSeq-P2 con diferentes índices. Todosde los cebadores debe ser purificado por HPLC o PAGE. <ol start="4"><li> Bibliotecas de oligonucleótidos pueden obtenerse a partir de una instalación de proveedor o núcleo comercial, o se generan utilizando un microarray basado programable sintetizador de oligonucleótidos como se describe por el fabricante. Resuspender los productos MCO en 100 l de tampón TE 0,1. </li><li> Ejecute las bibliotecas de oligonucleótidos en un 10% TBE-Urea desnaturalización gel de poliacrilamida. Cargar aproximadamente 1 pmol por carril y tinción con colorante fluorescente sensible a ssDNA para evaluar su calidad (Figura 2A). </li><li> Si una banda discreta correspondiente a los oligonucleótidos de longitud completa se puede visualizar (Figura 2A, carriles 1 y 2), escindir el correspondiente trozo de gel de acrilamida y se eluye oligonucleótidos en 100 l TE 0,1 durante la noche a temperatura ambiente con agitación. De lo contrario, continúe con el OLS suspensión cruda. </li><li> Potenciar y colas SfiI a la biblioteca de oligonucleótidos utilizando emulsión PCR 9 </<html> sup&gt;. </li><li> Establecer 50 l mezclas de reacción PCR como se describe en la Tabla 2. Luego combine con 300 l de aceite y surfactante mezcla desde el Micellula ADN Emulsión y kit de purificación y agitar durante 5 min a 4 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> Herculase II Fusión ADN polimerasa </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Reaction Buffer 5x Herculase II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM cada uno) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA (20 mg / ml) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_F Primer (25 mM) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R Primer (25 mM) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Plantilla OLS (1-10 attomol) </td><td> varía </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> a 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; Cuadro 2 mezcla de reacción de PCR de emulsión (fase acuosa). <ol start="9"><li> Utilizar la concentración que da el máximo rendimiento de los productos de amplificación sin la aparición de artefactos (véase la sección 1.12). </li><li> Prescindir de la emulsión resultante en tubos de PCR y realice 20 ciclos de PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 segundos a 95 ° C, 20 segundos a 55 ° C, 30 segundos a 72 ° C], 3 min a 95 ° C). </li><li> Piscina y romper cada 350 l de reacción de PCR en emulsión mediante la adición de 1 ml de isobutanol y brevemente vórtex, y luego purificar el producto de amplificación usando una columna de purificación de ADN. </li><li> Ejecutar una alícuota en un gel de agarosa al 2% o 4% para verificar la amplificación libre de artefactos (Figura 2B). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> Figura 2 Preparación de bibliotecas de síntesis de oligonucleótidos. A) </strong&gt; Tres bibliotecas de síntesis de oligonucleótidos primas diferentes (MCO) se ejecutan en la desnaturalización de 10% TBE-urea geles de poliacrilamida. Las bandas correspondientes a los oligonucleótidos de longitud completa (*) se pueden visualizar y extirpados de bibliotecas 1 y 2 Biblioteca 3 contiene contaminantes que interfieren con la purificación PAGE. Si este es el caso, proceder directamente a la PCR de amplificación. B) los productos de amplificación por PCR abierto y emulsión de la misma corrida biblioteca de oligonucleótidos en un gel de agarosa. La amplificación por PCR de las bibliotecas de oligonucleótidos complejos con frecuencia crea productos quiméricos y otros artefactos que pueden aparecer como bandas superiores e inferiores. Emulsión PCR puede minimizar estos artefactos. 2. Construcción de la Biblioteca <ol><li> Preparar un plásmido linealizado por digestión de columna vertebral pMPRA1 vector con SfiI a 50 ° C durante 2 horas, se ejecutan en un gel de agarosa al 1%, escindir la banda columna vertebral (en este caso, 2,5 kb) y purificar usando una columna de centrifugación purificación en gel. </li><li> Recopilaciónlos productos de la PCR de emulsión de la etapa 1.4 con SfiI a 50 ° C durante 2 horas y purifican utilizando columnas de purificación de ADN. </li><li> Para ligar la biblioteca promotor-tag en el esqueleto del vector linealizado, configurar las reacciones que contenían 100 ng del producto de PCR digerido, 50 ng de esqueleto del vector linealizado y ADN ligasa de T4. Incubar toda la noche a 16 ° C y luego se calienta a 65 ° C durante 20 min para inactivar la ligasa. </li><li> Transformar E. coli con la reacción de ligación. Para preservar la complejidad de la biblioteca, el objetivo de obtener al menos 10 veces más ufc que hay combinaciones de promotor-etiquetas distintas en la biblioteca diseñada. </li><li> Cuando el número total de etiquetas es de aproximadamente 100.000, el ufc objetivo típicamente se puede lograr mediante la realización de 6-8 transformaciones paralelas por biblioteca. </li><li> Para cada transformación, se combinan 50 l electrocompetentes E. células de E. coli con 2 l de mezcla de ligación en hielo. Transformar mediante electroporación, recuperar las células en 800 l SOCmedio por agitación a 37 ° C durante 1 h, y luego se combinan células de las transformaciones paralelas. </li><li> Para evaluar la eficiencia de transformación, placa diluciones seriadas de un alinquot de células recuperadas en placas de agar LB con 50 a 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba durante la noche a 37 ° C. Estimar ufc total, (cfu observado) x (factor de dilución) x (V - V) / V, donde V es el volumen total de células recuperadas y V es el volumen de la alícuota tomada para las diluciones en serie. </li><li> Al mismo tiempo, utilizar el resto de las células recuperadas para inocular 200 ml de LB suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina. Se cultivan las células a 37 ° C durante la noche en una incubadora con agitador y luego aislar el ADN plásmido siguiendo los procedimientos estándar. </li><li> Digerir una alícuota de la biblioteca de plásmido aislado con SfiI a 50 ° C durante 2 horas y correr en un gel de agarosa al 1% para confirmar la presencia de insertos. </li><li> Linealizar el plásmido biblioteca por cutting entre las variantes promotoras y etiquetas utilizando KpnI y XbaI. Para maximizar la eficiencia de la digestión, realizar digestiones de serie: </li><li> En primer lugar, digerir con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y purificar usando perlas magnéticas. En segundo lugar, digerir con XbaI con la adición de 1 U de fosfatasa alcalina de camarón a 37 ° C durante 2 h, el calor inactiva a 65 ° C durante 5 min, y luego se purifica usando perlas magnéticas. </li><li> Ejecutar una alícuota en un gel de agarosa al 1% para verificar la linealización completa. Si plásmido sin cortar es visible, el fragmento linealizado se purificó en gel debe ser. </li><li> Para generar una biblioteca de MPRA adecuados para la transfección en células de mamífero, ligar un ORF con KpnI / XbaI extremos -Compatible en la biblioteca intermedia linealizado. </li><li> Para preparar un fragmento ORF luc2 compatible desde pMPRAdonor1, digerir este plásmido con KpnI y XbaI a 37 ° C durante 1 hora y se ejecutan en un gel de agarosa al 1%. Cortar el fragmento ORF (1,7 kb en este caso) y se purifican usando una columna de gel de purificación de giro. </li><li> Clonar el fragmento ORF en la biblioteca intermedio linealizado como se describe en los pasos 2.3 a 2.8. </li><li> Digerir una parte alícuota (correspondiente a 1-2 g) de la biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y correr en un gel de agarosa al 1%. Si la biblioteca digerido se ejecuta como una sola banda, pase a la sección 3 Si se observan bandas adicionales (por lo general corresponde a remanente de construcciones intermedias), la biblioteca puede ser purificado de la siguiente manera: </li><li> Digerir 3-5 g de la biblioteca contaminada con KpnI a 37 ° C durante 1 hora y correr en un gel de agarosa al 0,8% durante la noche a 4 ° C. </li><li> Escindir la banda biblioteca correcta, purificar el ADN usando una columna de centrifugación purificación en gel y llevar a cabo la auto-ligación utilizando alta concentración de ADN ligasa de T4 a 37 ° C durante 1 hr. A continuación, repita la transformación y la biblioteca definitiva de aislamiento de ADN como se describe en el paso 2.8. </li></ol> 3. Transfection, Perturbación, y Aislamiento de ARN <ol><li> Para cada transfección independiente, la cultura el número requerido de células (como se determina por la complejidad de la biblioteca MPRA, ver Discusión) en un medio apropiado. Por ejemplo, cultivo de células HEK293T 17 / en DMEM suplementado con 10% de FBS y L-glutamina / penicilina / estreptomicina. Células de cultivo de al menos dos transfecciones independientes para cada biblioteca y condición experimental. </li><li> Transfectar las células cultivadas con plásmidos MPRA. El método y las condiciones de transfección debe ser optimizado para cada tipo de célula. Para cada muestra transfectadas, retener una parte alícuota (50-100 ng) de ADN plásmido como control emparejado. </li><li> Por ejemplo, transfectar 0,5 x 10 7 HEK293T / 17 células cultivadas a ~ 50% de confluencia en una placa de cultivo de 10 cm con el plásmido de ADN 10 mg en 1 ml de Opti-MEM I medio de suero reducido utilizando 30 l Lipofectamine LTX y 10 l de reactivo Plus. Retire la mezcla de transfección después de 5 horas y permitir lalas células se recuperen durante 24-48 h. </li><li> Opcionalmente, realice cualquier perturbación necesaria para activar secuencias reguladoras al contexto o dependientes de señales en la biblioteca diseñada. </li><li> Recoger las células y aislar poli (A) + mRNA utilizando columnas estándar oligo (dT) celulosa o perlas usando las instrucciones de su fabricante. </li><li> Asegúrese de que la capacidad máxima de unión de las columnas o los granos supere el importe total de ARNm que se espera de las células recogidas. Por ejemplo, el rendimiento esperado de la sección 3.3 es de aproximadamente 0,5-2,5 mg ARNm. </li></ol> 4. Tag-Seq <ol><li> Para eliminar el arrastre de ADN del vector de los lisados ​​de células transfectadas, tratar a cada muestra de ARNm 20 l con 1 l Turbo DNasa (2 U) y 2,3 l de tampón 10x Turbo DNasa a 37 ° C durante 1 hora, añadir 2,4 l Turbo DNasa inactivación reactivo en RT durante 5 min con mezcla, centrifugar a 10.000 g durante 90 seg, y luego transferir la solución a un tubo nuevo. </li><li> Compruebe<html> pureza mediante la realización de PCR como se describe en la sección 4.6 de 60-100 ng de cada muestra de ARNm, y luego ejecutar los productos en un gel de agarosa. Si amplicones específicos son visibles (0,25 kb si usa pMPRA1 con luc2), la columna de purificar el mRNA tratado y luego repetir el tratamiento DNasa. </li><li> Para generar bibliotecas de secuenciación-Tag Seq, convertir reportero ARNm en ADNc y añadir adaptadores de secuenciación por PCR. </li><li> Configurar mezclas de cebadores ARNm / RT como se describe en la Tabla 3. Incubar a 65 ° C durante 5 min, luego colocar en hielo. En paralelo, configurar las reacciones de síntesis de ADNc como se describe en la Tabla 4. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> muestra de ARNm (400-700 ng total) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Oligo-0DT (50 M) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM cada uno) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;&gt; Cuadro 3 ARN mezcla de cebadores / transcripción inversa para la síntesis de ADNc. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> 10x superíndice III RT Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Superíndice III (200 U / l) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla ADNc 4. mezcla de reacción de síntesis. <ol start="5"><li> Combinan suavemente imprimación mRNA / RT mezcla con mezclas de síntesis de ADNc. Incubar a 50 ° C durante 50 min, 85 ° C durante 5 min y luego se coloca en hielo. Finalmente, se incuba con 2 U de ribonucleasa H a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Configurar las reacciones de PCR como se describe en la Tabla 5 con 4-6 lcDNA mezcla de reacción o 50 ng de plásmido reportero como plantillas. A continuación, realizar la amplificación por PCR (95 ° C durante 2 min, 26 x [95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 seg], 72 ° C durante 3 min). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> 1x Volumen (l) </td></tr><tr><td> 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix </td><td> 25 </td></tr><tr><td> TagSeq_P1 Primer (25 mM) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> TagSeq_P2 Primer (25 mM) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Plantilla (ARNm, ADNc o ADN plásmido mix) </td><td> varía </td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> a 50 </td></tr></tbody></table> Tabla 5. mezcla de reacción de PCR Tag-Seq. <ol start="7"><li> Ejecutar los productos de PCR en un gel de agarosa al 2%, bandas especiales correspondientes a los amplicones biblioteca-Tag Sec (0,25 kb si se utilizapMPRA1 con luc2) y purificar estas utilizando columnas giratorias de purificación de gel. </li><li> Piscina, desnaturalizar y secuenciar los amplicones-Tag Sec purificados directamente con un instrumento de secuenciación de Illumina. </li><li> Filtro de baja calidad se lee mediante la eliminación de todo lo que a) contener una o más posiciones con una calidad Phred puntuación de menos de 30 dentro de la etiqueta secuenciado o b) que no coincide exactamente una etiqueta diseñada. Cuente el número de veces que cada etiqueta restante aparece en cada biblioteca. Normalizar la etiqueta cuenta con TPM (etiquetas por millón de etiquetas secuenciados) y luego calcular la relación de etiqueta cuenta derivados de ARNm más de etiqueta cuenta plásmido derivado para cada par de bibliotecas de secuenciación. Si varias etiquetas diferentes estaban vinculados a cada variante de secuencia, utilice sus ratios de la mediana para el análisis de aguas abajo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence.">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li><li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay.">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li><li>Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe&#8217;er, D., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+DNA+regulatory+elements+by+synthetic+saturation+mutagenesis.">High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis.</a> Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).</li><li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo.">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li><li>Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Bory&#324;, &. #. 3. 2. 1. ;. M., Rath, M., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantitative+enhancer+activity+maps+identified+by+STARR-seq.">Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq.</a> Science (New York, N. Y.). 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li><li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay.">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li><li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks.">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li><li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants.">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li><li>Sch&#252;tze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li><li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome.">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency. 
The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.
A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted CD). In practice, CD is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than CD. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then CD should be no more than ~200,000. Note that CD is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple &#8220;promoter bashing&#8221; experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test. 
If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements. 
Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.
It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

A correction to the author list has been made for article <a href="http://www.jove.com/video/51719">Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells</a>.

Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Ensayos Reporteros Massively Parallel (MPRA) permiten medir multiplexado de las actividades reguladoras de la transcripción de miles a cientos de miles de secuencias de ADN 1-7. En su aplicación más común, la multiplexación se logra mediante el acoplamiento de cada secuencia de interés a un gen indicador sintético que contiene una identificación de etiqueta de secuencia aguas abajo de un marco de lectura abierto (ORF; Figura 1). Después de la transfección, el aislamiento de ARN y secuenciación profunda de los extremos 3 &#39;de los transcritos del gen reportero, las actividades relativas de las secuencias unidas se pueden deducir de la abundancia relativa de sus etiquetas de identificación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> Figura 1 Descripción general de MPRA. Una biblioteca de reportero MPRA construcciones se construye acoplando secuencias reguladoras putativas a sintéticogenes indicadores que consisten en un &quot;inerte&quot; ORF (como GFP o luciferasa), seguido de una identificación de marcadores de secuencias. La biblioteca es transfectada en masa en una población de células cultivadas y ARNm transcrito reportero se recupera posteriormente. Secuenciación de profundidad se utiliza para contar el número de ocurrencias de cada etiqueta entre los mRNAs reportero y los plásmidos transfectados. La proporción de mRNA cuenta sobre los recuentos de plásmido puede utilizarse para inferir la actividad de la secuencia reguladora correspondiente. Adaptado con permiso de Melnikov, et al 2. MPRA se puede adaptar a una amplia variedad de diseños experimentales, incluyendo 1) la mutagénesis integral de elementos reguladores de genes individuales, 2) la exploración de nuevos elementos reguladores a través de un locus de interés, 3) probar el efecto de la variación genética natural en un conjunto de putativo promotores, potenciadores o silenciadores, y 4) ingeniería semi-racional de los elementos reguladores sintéticos. Libraries de variantes de secuencia pueden generarse usando una variedad de métodos, incluyendo la síntesis de la biblioteca de oligonucleótidos (OLS) en microarrays programables 2,3,6,7, conjunto de oligonucleótidos degenerados, 1,4 ligadura 8 combinatoria y la fragmentación de ADN genómico 5. Este protocolo describe la construcción de una biblioteca de variantes de promotor usando OLS y los vectores de pMPRA1 y pMPRAdonor1 (Addgene IDs 49349 y 49352, respectivamente; http://www.addgene.org), la transfección transitoria de esta biblioteca en células de mamífero cultivadas y la posterior cuantificación de las actividades promotoras de secuenciación profunda de sus etiquetas asociadas (Tag-Seq). Las versiones anteriores de este protocolo se utilizaron en la investigación publicada en Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) y en Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="954">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:359px;">Oligonucleotide library synthesis</td>
			<td style="width:201px;">Agilent, CustomArray or other OLS vendors</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
			<td style="width:275px;">If using OLS construction method</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:359px;">pMPRA1</td>
			<td style="width:201px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">49349</td>
			<td>MPRA plasmid backbone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">pMPRAdonor1</td>
			<td style="width:201px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">49352</td>
			<td>luc2 ORF donor plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td>
			<td style="width:201px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>OLS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:359px;">Novex TBE-Urea Gels, 10%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">EC6875BOX</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Novex TBA-Urea Sample Buffer</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC6876</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Micellula DNA Emulsion &#38; Purification Kit</td>
			<td style="width:201px;">EURx/CHIMERx</td>
			<td style="width:119px;">3600-01</td>
			<td>Library amplification by emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:201px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600675</td>
			<td>Polymerase for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SfiI</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0123S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">XbaI</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0145S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C4040-50</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LB agar and liquid media with carbenicllin</td>
			<td style="width:201px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Growth media for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">E-Gel EX Gels 1%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G4010-01</td>
			<td>Library verification and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">E-Gel EX Gels, 2%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G4010-02</td>
			<td>Library verification and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MinElute Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:201px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28604</td>
			<td>Library and backbone purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:201px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12362</td>
			<td>Library DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell culture media</td>
			<td style="width:201px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Experiment-specific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Transfection reagents</td>
			<td style="width:201px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Experiment-specific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MicroPoly(A)Purist Kit</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1919</td>
			<td>mRNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td>Plasmid DNA removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080-051</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix</td>
			<td style="width:201px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600850</td>
			<td>Polymerase for Tag-Seq PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Primers (see text)</td>
			<td style="width:201px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
			<td>PAGE purify Tag-Seq primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

massively parallel reporter assays in cultured mammalian cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

MPRA facilita de alta resolución, la disección cuantitativa de las relaciones de secuencia de la actividad de elementos reguladores transcripcionales. Un experimento exitoso MPRA típicamente producirá mediciones altamente reproducibles para la mayoría de las secuencias en la biblioteca transfectadas (Figura 3A). Si se observa una mala reproducibilidad (Figura 3B), esto es indicativo de una concentración demasiado baja de mRNAs reportero en las muestras de ARN recuperado, ya sea debido a 1) una baja actividad absoluta entre las secuencias ensayadas, o 2) la baja eficiencia de transfección. La figura 4 muestra un representante &quot;información de la huella&quot; 1,2 generada por el ensayo de ~ 37.000 variantes aleatorias de una secuencia de 145 pb aguas arriba del gen IFNB humano en células HEK293 con o sin exposición al virus Sendai. El promotor TATA-box y conocido promotor de proximal 10 pueden ser claramente identificados como regi rico en informacióncomplementos de una manera dependiente de virus. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> Figura 3.-Tag Sec reproducibilidad diagramas de dispersión que muestran ejemplos de datos de la etiqueta de la Seq dos transfecciones independientes replicadas con alta (A) y baja (B) la reproducibilidad.. Este último gráfico muestra muchas etiquetas de valores atípicos con recuentos de alta mRNA en sólo una de las dos repeticiones. Tales artefactos típicamente indican que las concentraciones de ARNm reportero eran demasiado bajos para la amplificación de PCR cuantitativa, ya sea debido a las actividades absolutas bajas entre los constructos informadores, o bajas eficiencias de transfección. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> Figura 4. Información footprinting del sitio de inicio de transcripción IFNB humano y potenciador proximal. </strong&gt; Aproximadamente 37.000 variantes aleatorias de un (nt) región de 145 nucleótidos aguas arriba del gen IFNB humano se analizaron utilizando MPRA en células HEK293 con (A) y sin (B) la exposición al virus Sendai. Las barras azules muestran la información mutua entre la salida reportero y el nucleótido en cada posición. El potenciador proximal y la caja TATA se destacan como las regiones de alto contenido de información a la infección viral.

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Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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