Este protocolo de genotipado de la MLB ha aumentado considerablemente nuestra comprensión de la epidemiología y la estructura poblacional global de Yersinia ruckeri, una bacteria patógena de pescado de importancia internacional. En comparación con los esquemas de mecanografía Yersinia ruckeri previamente establecidos, ofrece una resolución de deformación unitaria muy alta. El procedimiento es simple, barato y otorga resultados portátiles que se pueden comparar fácilmente entre laboratorios.
La técnica mejora en gran medida la especificidad diagnóstica y permite el rastreo de infecciones. Por ejemplo, ahora a menudo podemos distinguir los clones virulentos de Yersinia ruckeri existentes en el contexto de cepas ambientales no virulentas. Demostrando el procedimiento estará Saima Nasrin Mohammad, un técnico en nuestro laboratorio.
Para empezar, utilice bucles de inoculación estériles para sembrar cultivos puros de Yersinia ruckeri en cualquier tipo de agar adecuado en los platos de Petri. Incubar a 22 grados centígrados durante uno o dos días o 15 grados centígrados durante tres a cuatro días. Después de eso, usando bucles de inoculación, escoja una sola colonia representativa de cada plato de Petri y transfiera a tubos centrífugos de 1,5 mililitros, que contienen 50 microlitros de agua ultra purificada para resuspender.
Vórtice brevemente e incubar durante siete minutos en un bloque de calentamiento a 100 grados celsius. Luego, centrifugar a 16.000 g durante tres minutos y use una pipeta para transferir cuidadosamente el ADN de la plantilla de sobrenadante en tubos de centrífuga vacíos de 1,5 mililitros. Continúe con el siguiente paso o almacene el ADN a 20 grados centígrados.
Para preparar mezclas maestras, primero calcule los volúmenes de reactivos de acuerdo con el número de muestras bacterianas a analizar, representando también un control negativo y otro positivo, y un volumen final del 10% de excedente, como se detalla en el manuscrito. Tenga en cuenta que se utilizan diferentes concentraciones de imprimación. En dos tubos centrífugos separados, uno por ensayo de PCR, agregue PCR multiplex más mezcla maestra, imprimaciones y agua libre de RNase.
Vortex el maestro preparado se mezcla suavemente a baja velocidad y luego, distribuir 22 microlitros de cada mezcla maestra por separado en pozos individuales en tiras de PCR o placas. A continuación, agregue tres microlitros de la plantilla de ADN preparada a cada mezcla maestra que contiene bien;dos pozos por muestra de bacterias, uno para cada ensayo. Utilice ADN de una cepa de Yersinia ruckeri verificada para un control positivo y agua ultra purificada para un control negativo.
Selle y centrifuga brevemente. Cargue las reacciones preparadas en un termociclista PCR y configure el programa de acuerdo con el manuscrito. El programa se completará en menos de tres horas.
De acuerdo con las recomendaciones del fabricante, añadir polvo de gel de agarosa en un tampón TBE para alcanzar 1.5 porcentaje de peso / volumen y calor para disolver. Antes de la fundición, enfríe brevemente la solución de gel disuelto bajo agua corriente, agregue 5 microlitros de colorante de ácido nucleico fluorescente por cada 50 microlitros de solución de gel y mezcle. Montar y nivelar la bandeja de fundición.
Agregue conos según corresponda para el número de muestras. Vierta la solución de gel en el molde y espere a que se solidifique. Después de eso, sumerja el yeso que contiene el gel en una tampón TBE en un sistema de electroforesis de gel.
Mezclar cinco microlitros de los productos PCR junto con dos microlitros de tinte de carga en nuevas tiras de PCR. Transfiera cinco microlitros de las mezclas a los pozos en el gel. Ahorre al menos uno bien vacío.
Añadir cinco microlitros de escalera de ADN en el pozo vacío como referencia. Enchufe los electrodos y ejecute el gel a 110 voltios por 15 centímetros durante aproximadamente una hora. Utilice un sistema de imágenes de gel basado en rayos UV para verificar la presencia de varias bandas que representan los amplicones de la REPÚBLICA Popular China.
Después de la confirmación de los amplicons PCR, utilice nuevas tiras o placas de PCR para diluir los productos de PCR de uno a 10 en agua purificada. Vórtice y centrifugar brevemente. Mientras trabaja en un armario de humos, prepare una mezcla maestra en un tubo centrífugo que consiste en formamida y solución estándar de tamaño de referencia.
De acuerdo con el número de productos PCR a analizar, utilice volúmenes de reactivos como se detalla en el manuscrito. Permita un volumen excedente del 10%. Vortex brevemente y distribuir 9.5 microlitros en pozos individuales en una placa PCR apropiada para el sistema de electroforesis capilar disponible.
A continuación, agregue 0,5 microlitros de producto PCR diluido. Selle y centrifuga brevemente. A continuación, cargue la placa que contiene las muestras en un ciclor térmico pcR y desnaturalizar las muestras a 95 grados Celsius durante tres minutos antes de enfriar a cuatro grados Celsius indefinidamente.
Centrifugar a 1000 g durante un minuto, retire cuidadosamente el sello y cargue la placa en un sistema de electroforesis capilar calibrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecutar la electroforesis capilar de análisis de fragmentos, utilizando reactivos según corresponda para el aparato de elección, y ajustar las condiciones de funcionamiento de acuerdo con la descripción en el manuscrito. Para la llamada de tamaño de electroforesis capilar Yersinia ruckeri VNTR, primero importe archivos de resultados de electroforesis capilar en el software Gene Mapper 5.
Establezca el método de análisis en Microsatellite Default, seleccione la opción de producto adecuada en el estándar de tamaño y, a continuación, pulse el botón Analizar. A través del editor de coincidencias de tamaño, verifique la identificación correcta de los fragmentos estándar de tamaño y rectifique cualquier asignación visiblemente errónea. A continuación, seleccione la muestra que desea leer, pulse el botón Mostrar trazado y pulse Control A para habilitar la vista de la tabla de tamaño.
Mientras esté en el panel superior, mantenga presionado Control, mientras hace clic en los cinco picos que representan los amplicons VNTR. Presione Control G para filtrar la tabla de tamaño, mostrando solo las características de los cinco picos resaltados, y registre las llamadas de tamaño para cada locus VNTR para la aplicación de nivel inferior. Para tener en cuenta los patrones de movilidad de amplicon sesgados durante la electroforesis capilar, calcule los recuentos precisos de repeticiones de VNTR empleando las llamadas de tamaño adquiridas en combinación con las variables específicas del locus.
La fórmula se puede implementar en una plantilla de hoja de cálculo para la automatización. En la hoja de cálculo, la repetición de VNRT calculada redonda cuenta con el entero más cercano antes del análisis posterior. En el software BioNumerics, cree una nueva base de datos y opte por activar el complemento MLVA.
En el panel de tipo de experimento, presione Crear nuevo tipo de experimento, elija Tipo de carácter y utilice la configuración predeterminada cuando se le solicite. A continuación, seleccione el nuevo experimento y agregue nuevos caracteres para cada uno de los 10 loci VNTR, empleando de cero a 100 como el rango de valores. De vuelta en el panel principal, importe los recuentos de repetición Yersinia ruckeri VNTR y los datos del método seleccionando los campos y caracteres de importación.
Busque el archivo donde se almacena y realice selecciones en la columna Tipo de destino. Para los VNTR, esto significa seleccionar el valor de carácter adecuado, mientras que los metadatos varios se clasifican como campos de información de entrada. Las elecciones tomadas pueden almacenarse como una plantilla con el fin de facilitar el proceso para más adelante.
Seleccione muestras importadas destinadas al análisis de clúster MST y, a continuación, haga clic en el botón Crear nueva comparación en el panel Comparaciones. Si lo desea para la presentación visual del MST, asigne los ejemplos a grupos de color, por ejemplo, según una característica de metadatos determinada. A continuación, seleccione Análisis de clúster avanzado y MST para datos categóricos para generar un diagrama MST basado en los ejemplos elegidos.
Modifique aún más la presentación visual del MST añadiendo parámetros de partición, longitudes cruzadas, etiquetado de ramas de nodo, etc. Si es necesario, exporte el MST finalizado en el formato deseado utilizando la selección Exportar imagen. Después de la PCR multiplex, la imagen de electroforesis de gel verifica la presencia de múltiples amplicons en los 12 carriles que contienen muestras, con el primer carril que representa la escalera de ADN utilizada.
En electroferogramas resultantes de la electroforesis capilar, los diferentes loci VNTR se pueden identificar según una combinación de tamaño y etiquetado de tinte. Los picos naranjas representan el tamaño empleado. Se muestra un árbol de expansión mínimo de ejemplo, basado en perfiles MLVA de aislados de Yersinia Ruckeri recuperados del salmón del Atlántico en cinco granjas noruegas diferentes.
Se puede observar una clara tendencia a la agrupación vinculada al origen de la granja. La identificación por parte de MLVA de diferentes clones de Yersinia ruckeri que dominan, por ejemplo, en determinadas regiones geográficas de especies de peces, ya ha sido aprovechada para mejorar las estrategias de vacunación contra este patógeno.
