פרוטוקול Genotyping MLB זה הגביר מאוד את הבנתנו את האפידמיולוגיה ואת מבנה האוכלוסייה העולמי של Yersinia ruckeri, חיידק פתוגניים דגים חשוב בינלאומית. בהשוואה לערכות הקלדה Yersinia ruckeri שהוקמו בעבר, הוא מציע רזולוציית זן גבוהה מאוד. ההליך הוא פשוט, זול, ופרסים תוצאות ניידות שניתן להשוות בקלות על פני מעבדות.
הטכניקה משפרת מאוד את ספציפיות האבחון ומאפשרת מעקב אחר זיהומים. לדוגמה, לעתים קרובות אנו יכולים להבחין בין שיבוטים ארסינריים של ירסיניה רוקרי הקיימים על רקע זנים סביבתיים לא ארסיים. הדגימה להליך תהיה סאימה נסרין מוחמד, טכנאית במעבדה שלנו.
כדי להתחיל, להשתמש לולאות חיסון סטרילי לזרוע Yersinia ruckeri תרבויות טהורות על כל סוג אגר מתאים על מנות פטרי. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים או 15 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר מכן, באמצעות לולאות חיסון, לבחור מושבה מייצגת אחת מכל צלחת פטרי ולהעביר צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר, המכיל 50 microliters של מים מטוהרים במיוחד כדי resuspend.
מערבולת לזמן קצר דגירה במשך שבע דקות על בלוק חימום ב 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 16, 000 גרם במשך שלוש דקות ולהשתמש פיפטה להעביר בזהירות את ה-DNA תבנית על טבעי לתוך צינורות צנטריפוגה ריקים 1.5 מיליליטר. המשך לשלב הבא או לאחסן את ה-DNA ב 20 מעלות צלזיוס.
כדי להכין תערובות אב, תחילה לחשב כמויות reagent על פי מספר דגימות חיידקים שיש לנתח, גם חשבונאות שליטה שלילית אחת חיובית אחת, ונפח סופי 10%עודף, כמפורט בכתב היד. שים לב כי נעשה שימוש בריכוזי פריימר שונים. בשני צינורות צנטריפוגה נפרדים, אחד לכל שעון PCR, הוסף PCR מולטיפלקס בתוספת תערובת אב, פריימרים ומים נטולי RNase.
Vortex המאסטר המוכן מתערבב בעדינות במהירות נמוכה ולאחר מכן, להפיץ 22 microliters של כל מאסטר לערבב בנפרד לתוך בארות בודדות על רצועות PCR או צלחות. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של תבנית הדנ"א המוכנה לכל באר המכילה תערובת ראשית;שתי בארות לכל דגימת חיידקים, אחת לכל בדיקה. השתמש ב- DNA מזן Yersinia ruckeri מאומת לשליטה חיובית, ומים מטוהרים במיוחד לשליטה שלילית.
חותם וצנטריפוגה לזמן קצר. טען את התגובות המוכנות על רוכב מחשב תרמו PCR והגדר את התוכנית על פי כתב היד. התוכנית תושלם תוך פחות משלוש שעות.
על פי המלצות היצרן, להוסיף אבקת ג'ל אגרוז פעם אחת חיץ TBE להגיע 1.5 משקל / נפח אחוז וחום להתמוסס. לפני הליהוק, מצננים את תמיסת הג'ל המומסת בקצרה תחת מים זורמים, מוסיפים 5 מיקרוליטרים של צבע חומצת גרעין פלואורסצנטית לכל 50 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל ומערבבים. להרכיב וליישר את מגש הליהוק.
הוסף קונוסים בהתאם למספר הדגימות. יוצקים את ת פתרון הג'ל לתוך הגבס ומחכים שהוא יתמצק. לאחר מכן, להטביע את הגבס המכיל את הג'ל פעם אחת חיץ TBE במערכת אלקטרופורזה ג'ל.
מערבבים חמישה מיקרוליטרים של מוצרי PCR יחד עם שני מיקרוליטרים של טעינת צבע ברצועות PCR חדשות. מעבירים חמישה מיקרוליטרים של תערובות ל בארות בג'ל. שמור לפחות אחד ריק היטב.
הוסף חמישה מיקרוליטרים של סולם DNA באר הריקה לעיון. חבר את האלקטרודות והפעל את הג'ל ב-110 וולט ל-15 ס"מ למשך כשעה. השתמש במערכת דימות ג'ל מבוססת UV כדי לאמת נוכחות של רצועות מרובות המייצגות אמפיליקונים של PRC.
לאחר אישור של אמפיליקונים PCR, להשתמש רצועות PCR חדש או צלחות לדלל מוצרי PCR אחד עד 10 במים מטוהרים. וורטקס וצנטריפוגה בקצרה. תוך כדי עבודה בארון אדים, הכינו תערובת אב בצינור צנטריפוגה המורכב מ-formamide ופתרון סטנדרטי בגודל התייחסות.
על פי מספר מוצרי PCR שיש לנתח, השתמשו בכמויות רהגנט כמפורט בכתב היד. אפשר אמצעי אחסון עודף של 10%.. Vortex בקצרה ולהפיץ 9.5 microliters לתוך בארות בודדות על צלחת PCR מתאים למערכת אלקטרופורזה נימי זמין.
לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטרים של מוצר PCR מדולל. חותם וצנטריפוגה לזמן קצר. לאחר מכן, לטעון את הצלחת המכילה את הדגימות לתוך PCR תרמו רוכב ו denature הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות לפני הקירור לארבע מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
צנטריפוגה ב 1000 גרם לדקה אחת, להסיר בזהירות את החותם, ולהעמיס את הצלחת על מערכת אלקטרופורזה נימי מכויל על פי הוראות היצרן. הפעל אלקטרופורזה נימית ניתוח שבר, באמצעות ריאגנטים בהתאם למנגנונים של בחירה, ולהתאים את תנאי הריצה על פי התיאור בכתב היד. עבור Yersinia ruckeri VNTR גודל אלקטרופורזה נימי קורא, הראשון לייבא אלקטרופורזה נימי תוצאה קבצים לתוך ג'ין Mapper 5 תוכנה.
הגדר את שיטת הניתוח ל, ברירת מחדל Microsatellite, בחר את בחירת המוצר המתאימה תחת תקן גודל ולאחר מכן לחץ על לחצן נתח. באמצעות עורך התאמת הגודל, אמת את הזיהוי הנכון של שברי תקן גודל ותקן הקצאות שגויות בעליל. לאחר מכן, בחר את הדוגמה לקריאה, לחץ על לחצן הצג התוויית תצוגה והקש Control A כדי להפוך תצוגה לזמינה של טבלת שינוי הגודל.
בעוד בלוח העליון, החזק את מקש Control לחוץ, תוך לחיצה על חמשת הפסגות המייצגות את אמפיליקונים VNTR. הקש Control G כדי לסנן את טבלת הגודל, המציג רק מאפיינים של חמש הפסגות המסומן, והתזמן את קריאות הגודל עבור כל לוקוס VNTR עבור יישום במורד הזרם. על מנת להסביר דפוסי ניידות אמפייקון מוטה במהלך אלקטרופורזה נימי, לחשב ספירות חוזרות VNTR מדויקות על ידי העסקת שיחות גודל שנרכשו בשילוב עם משתנים ספציפיים לוקוס.
ניתן ליישם את הנוסחה בתבנית גיליון אלקטרוני לאוטומציה. בגיליון האלקטרוני, ספירה חוזרת מחושבת מעוגל של VNRT נחשבת לספר השלם הקרוב ביותר לפני ניתוח במורד הזרם. בתוכנת BioNumerics, צור מסד נתונים חדש ובחר להפעיל את תוסף MLVA.
בחלונית 'סוג ניסוי', לחצו על 'צור סוג ניסוי חדש', בחרו 'סוג תו' ולהשתמש בהגדרות ברירת המחדל כשתתבקשו. לאחר מכן בחר את הניסוי החדש והוסף תווים חדשים עבור כל אחד מ- 10 Loci VNTR, תוך שימוש באפס עד 100 כטווח הערכים. בחזרה בלוח הראשי, לייבא Yersinia ruckeri VNTR ספירות חוזרות נתוני שיטה על ידי בחירת ייבוא שדות ותווים.
אתר את הקובץ שבו קובץ זה מאוחסן ובצע בחירות בעמודה סוג יעד. עבור VNTRs, משמעות הדבר היא בחירת ערך התו המתאים, בעוד המטה-נתונים ה שונים מסווגים כשדות מידע הזנה. ניתן לאחסן את האפשרויות שבוצעו כתבנית כדי להקל על התהליך במועד מאוחר יותר.
בחרו דגימות מיובאות המיועדות לניתוח אשכול MST ולחצו על הלחצן 'צור השוואה חדשה' בחלונית 'השוואות'. אם תרצה בהצגה החזותית של ה- MST, הקצה את הדגימות לקבוצות צבעוניות, לדוגמה, בהתאם לתכונת מטה-נתונים מסוימת. לאחר מכן, בחר ניתוח אשכול מתקדם ו- MST עבור נתונים קטגוריים כדי ליצור דיאגרמת MST המבוססת על הדוגמאות שנבחרו.
עוד לשנות את המצגת החזותית של MST על ידי הוספת פרמטרים מחיצה, אורכים צולבת, תיוג הסתעפות צומת, וכו '. במידת הצורך, ייצאו את ה- MST הסופי בתבנית הרצויה בעזרת הבחירה 'ייצוא תמונה'. בעקבות PCR מולטיפלקס, תמונת אלקטרופורזה ג'ל מאמתת את נוכחותם של אמפילונים מרובים בכל 12 הנתיבים המכילים דגימות, כאשר הנתיב הראשון מייצג את סולם ה- DNA המשמש.
באלקטרופרוגרמות הנובעות מאלקטרופורזה נימית, ניתן לזהות את לוצי VNTR השונים על פי שילוב של גודל ותיוג צבע. פסגות כתומות מייצגות את תקן הגודל המועסק. מוצגת דוגמה לעץ פורש מינימלי, המבוסס על פרופילי MLVA של ירסיניה רוקרי המבודדים שנמצאו מסלמון אטלנטי בחמש חוות נורווגיות שונות.
ניתן לראות נטייה ברורה לקיבוץ באשכולות המקושרת למקור החווה. הזיהוי על ידי MLVA של שיבוטים שונים Yersinia ruckeri השולטים, למשל, באזורים גיאוגרפיים מסוימים של מיני דגים, כבר נוצל לשיפור אסטרטגיות החיסון נגד פתוגן זה.
