Utilizamos el método de la vena de cola para generar metástasis cerebrales en modelos de ratón utilizando líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de mama inflamatorio, o IBC, una forma altamente agresiva de cáncer de mama primario. La generación de metástasis cerebrales en modelos de ratón suele implicar inyecciones intracardíacas o intracarotídeas. Sin embargo, el método de la vena de cola ofrece una ventaja sobre estas técnicas, ya que imita mejor los pasos de la colonización de la metástasis cerebral y es relativamente sencillo de realizar.
Los doctores Xiaoding Hu y Emilly Villodre, ambos instructores en mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Para detectar metástasis cerebrales mediante imágenes GFP de ocho a 10 semanas después de la inyección de células tumorales, desinfecte el ratón con etanol al 70% y retire el pelaje de la cabeza y las orejas. Corta la zona cervical del cuello.
Extirpar y extraer el cráneo para permitir que se extraiga el cerebro. Coloque el cerebro en un casete de papel desechable y coloque el casete en un recipiente de DPBS frío durante no más de una hora. Para obtener imágenes por microscopía estereoscópica, transfiera el cerebro a una tapa de plato de tejido de 100 centímetros bajo un microscopio estereoscópico equipado con luz ultravioleta y seleccione el objetivo de 0,5x para permitir la visualización de todo el cerebro.
Presione la vista en vivo y enfoque la vista mientras el cerebro está en posición ventral. Seleccione el filtro apropiado en el software y el microscopio para el marcador fluorescente en las células y tome una fotografía. Sin mover la muestra, cambie a imágenes de campo claro y seleccione el filtro de campo claro.
Toma una foto. A continuación, imagine el cerebro en posición dorsal como se demostró anteriormente. Para analizar las imágenes de todo el cerebro, primero convierta los archivos de imagen de TIFF a JPEG para que puedan abrirse con cualquier computadora que no tenga el software asociado.
A continuación, abra un par de imágenes fluorescentes y de campo claro y seleccione los canales de archivo y combinación. Seleccione los componentes adecuados, haga clic en Aceptar y guarde la imagen combinada. Para cuantificar el área del tumor cerebral en la imagen fluorescente, seleccione selección automática.
Mueva la flecha al área de posición GFP y haga clic para crear una selección automáticamente. A continuación, haga clic de nuevo para confirmar la selección. Se mostrarán todas las medidas.
Si se puede observar más de un área positiva de GFP, repita la medición con el área siguiente. Las lesiones metastásicas cerebrales pueden detectarse tan pronto como ocho semanas después de la inyección mediante imágenes de luciferasa y microscopía estereofluorescente. Después de la obtención de imágenes, se pueden fijar y procesar partes de las metástasis cerebrales en formol para la tinción con hematoxilina y eosina a fin de validar la presencia de lesiones de metástasis cerebrales, y para la tinción inmunohistoquímica con el fin de detectar marcadores proteicos específicos de interés.
Al intentar este protocolo, es importante mantener la viabilidad celular manteniendo las células en hielo durante no más de una hora, y evitar las burbujas de aire en la suspensión celular para evitar la formación de émbolos y la mortalidad de los ratones. Después de la inyección en la vena de la cola, monitoreamos el crecimiento y la progresión de la metástasis cerebral con imágenes de luciferasa. Después de la eutanasia, la microscopía estereofluorescente y la histología confirmaron lesiones de metástasis.
