Name: phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Estamos agradecidos a Kaz Nagaosa y Akiko Shiratsuchi por su consejo.

1. Preparación <ol><li> Preparación de placas de agar de jugo de uva fresca <ol><li> Añadir 100 ml de agua a 4,4 g de agar y calentar la mezcla en un horno de microondas para disolver el agar. </li><li> Añadir 80 ml de jugo de uva fresca, 5 ml de ácido acético y 5 ml de etanol en solución de agar. </li><li> Verter aproximadamente 1,5 ml de la solución con una pipeta en cada portaobjetos de vidrio y dejar que se solidifique. </li></ol></li><li> Preparación de placas de 6 cm de placa de agarosa <ol><li> Añadir 50 ml de agua a 0,5 g de agarosa y calentar la mezcla en un horno de microondas para disolver la agarosa. </li><li> Verter aproximadamente 2,5 ml de solución de agarosa en un plato de 6 cm con una pipeta. </li></ol></li></ol> 2. Etapa 16 Colección de embriones <ol><li> Recoger las moscas adultas, y agregar 200 hembras y 200 machos en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Ponga un plato de agar de jugo de uva fresco en la levadura en el tubo de 50 ml y cierre con una esponja capag. </li><li> Incubar las moscas a 16 ° C en la luz durante 2 - 3 días. Cambiar la placa una vez al día. </li><li> Mover las moscas a la oscuridad a 25 ° C durante 1 h. </li><li> Cambiar el plato viejo a uno nuevo sin levadura. Permitir que las moscas pongan huevos durante 2 h. </li><li> Recoger la placa e incubar a 16 ° C durante 26 h. </li><li> Recoger los embriones de la placa con un pincel en 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Lavar los embriones dos veces con 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Con el fin de eliminar el corion, agregar 1,2 ml de solución de hipoclorito de sodio (2,2 - 3,4% Cl) a los embriones durante 3 min. </li><li> Lavar los embriones 4 veces con 1 mL de PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Colocar los embriones en placas de 6 cm de placa de agarosa. Recoge los embriones de la etapa 16 bajo un microscopio como describe Roberts 20 . Recoja aproximadamente 50 embriones en un tubo de prueba micro de Treff de 1,5 ml con una micropipeta. </li></ol> 3. PrepaRación de células embrionarias <ol><li> Lavar los embriones dos veces con 150 μL de PBS. </li><li> Homogeneizar los embriones 30 veces en un tubo de micro test de 1,5 ml y mezclador de pellets en presencia de 200 μl de colagenasa (0,25% (p / v)) en PBS. </li><li> Disperse las células embrionarias pipeteando 10 veces, y mover la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Incubar las células a 37 ° C durante 1 min en un baño de agua. Repita este paso dos veces. </li><li> Añadir 800 μl de PBS a la suspensión celular y centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 200 μ l de tripsina (0,25% (p / v)) en PBS a las células. Disperse las células embrionarias pipeteando 50 veces. </li><li> Filtrar la suspensión celular con un filtro de células de 70 μm. </li><li> Con el fin de detener la actividad tripsina, añadir 40 μ l de suero fetal bovino inactivado por calor a la suspensión de células filtradas. Añadir 800 μl de PBS y centrifugar a 1.400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Eliminar los supernatosNt, suspender las células precipitadas en 200 μl de PBS y centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Se retira el sobrenadante y se suspenden las células precipitadas en 30 μl de PBS. </li><li> Montar la suspensión de células preparada en diapositivas de cristal revestidas con aminopropil trietoxisilano, y esperar 10-15 minutos hasta que las células se adhieran a las diapositivas de vidrio. </li><li> Retire la solución restante en los portaobjetos de vidrio con una pipeta. Montar 60 - 70 μL de PBS que contenga PFA al 4% (p / v) (paraformaldehído) sobre las células durante 10 - 15 min para la fijación. </li><li> Retire la solución de fijación y coloque los portaobjetos de vidrio en PBS durante más de 1 min. </li></ol> 4. Tinción de los hemocitos <ol><li> La inmunotinción con un anticuerpo anti-Croquemort <ol><li> Se empapan en serie los portaobjetos de vidrio en metanol durante 10 min, en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min y luego en PBS durante 10 min. </li><li> Montar 20 μl de suero de cerdo entero al 5% (v / v) en PBSNg 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células para el bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Eliminar la solución de las diapositivas de vidrio y montar 20 μl de antisuero anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a 4 ° C durante la noche. </li><li> Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces. </li><li> Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min. </li><li> Colocar 20 μl de IgG anti-rata marcada con fosfatasa alcalina (0,5% (v / v)) en PBS que contiene 0,3% (v / v) de suero de cerdo entero Triton X-100 y 5% (v / v) Temperatura durante 1 h. </li><li> Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces. </li><li> Remojar portaobjetos de vidrio en tampón que contenía 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 durante 10 min. </li><li> La solución de sustrato de fosfatasa de montaje que contiene 0,23 mg / ml de 5-bromo-4cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / ml nitro azul tetrazolio (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 en las células. </li><li> Observar las células bajo un microscopio para una tinción adecuada. Cuando aparecen fuertes señales púrpuras en los gránulos de los hemocitos, se retira la solución del sustrato y se empapa las diapositivas de vidrio en un tampón que consiste en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM. Se recomienda una tinción de aproximadamente 5 a 10 minutos. </li></ol></li><li> La inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP (otra opción para la tinción de hemocitos) <ol><li> Se empapan en serie las láminas de vidrio en metanol durante 10 min, PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min y PBS durante 10 min. </li><li> Monte 20 μl de suero entero de cerdo al 5% (v / v) en PBS que contenga Triton X-100 al 0,2% (v / v) en las células para bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Eliminar la solución en portaobjetos de vidrio y montar 20 μl del anticuerpo anti-GFP de ratón (1% (v / v)) / PBS cObteniendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces. </li><li> Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min. </li><li> Colocar 20 μl de IgG anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (0,5% (v / v)) en PBS que contiene 0,3% (v / v) de suero de cerdo entero de Triton X-100 y 5% (v / v) Temperatura durante 1 h. </li><li> Se empapan los portaobjetos de vidrio en PBS que contiene 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min 5 veces. </li><li> Remojar portaobjetos de vidrio en tampón constituido por 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 durante 10 min. </li><li> Montar la solución de sustrato de fosfatasa que contiene 0,23 mg / ml de BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl 50 mM 2 en las células. </li><li> Observar las células bajo un microscopio para una tinción adecuada. Cuando las señales de color púrpura aparecen en hemocitos enteros, retire la solución de sustrato y pase las diapositivas en un tampón que consiste enDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM. Se recomienda una tinción de aproximadamente 10 - 15 min. </li></ol></li></ol> 5. Stain Apoptotic Cells de TUNEL <ol><li> Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 5 min. </li><li> Repita con el nuevo PBS. </li><li> Monte el tampón de equilibrio (véase la Tabla de Materiales) sobre las células durante 10 min. </li><li> Retire la solución de los portaobjetos de vidrio y monte 20 μL de solución de TdT que contenga 5 μL de desoxinucleotidil transferasa terminal y 15 μL de tampón de reacción en las células a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Retirar la solución de los portaobjetos de vidrio y empapar las diapositivas en un tampón que consiste en 0,5 mL de STOP / tampón de lavado y 17 mL de agua. </li><li> Remoje las diapositivas en PBS durante 5 min 3 veces. </li><li> Montar 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidasa en las células a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Remoje las diapositivas de vidrio en PBS durante 5 min 4 veces. </li><li> Sumerja los portaobjetos de vidrio en solución de sustrato de peroxidasa que consta de 30 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 conteniendoga completo espátula micro de 3,3&#39;-diaminobencidina tetrahydrichloride (DAB), y 0,002% (v / v) H 2 O 2 durante 30 s. </li><li> Repita el paso 5.9 hasta que las células apoptóticas estén manchadas de color marrón. Sumerja los portaobjetos de vidrio en agua para detener la reacción de la peroxidasa. </li><li> Encierre las células con agua para la observación. </li></ol> 6. Medir el nivel de fagocitosis de las células apoptóticas <ol><li> Observe las muestras bajo un microscopio óptico para evaluar el nivel de fagocitosis. Contar células positivas a Croquemort o células GFP positivas como hemocitos, células positivas a TUNEL como células apoptóticas y células positivas dobles como hemocitos fagocitantes. </li><li> El índice fagocítico se define como el número de células dobles positivas al número total de células positivas a Croquemort o células positivas para GFP. Se recomienda observar más de 300 hemocitos. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<html> En este documento se describió un ensayo de fagocitosis utilizando embriones de Drosophila . Mediante el uso de células embrionarias dispersas para medir la fagocitosis cuantitativamente, los hemocitos, los fagocitos profesionales de Drosophila , son inmunocorados para el marcador de hemocitos Croquemort o srpHemo- dirigido GFP, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL en este protocolo. El nivel de fagocitosis se expresa como un índice fagocítico contando el número tota...

En animales metazoarios, por ejemplo el nematodo Caenorhabditis elegans , la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , y ratones y humanos, un gran número de células sufren apoptosis durante el desarrollo para modelar sus cuerpos y en la edad adulta para mantener la homeostasis 1 , 2 . Las células apoptóticas necesitan ser eliminadas rápidamente porque inducen inflamación en los tejidos circundantes liberando materiales intracelulares inmunogénicos si no se eliminan por completo 3 . Para facilitar la remoción rápida, las células apoptóticas presentan las denominadas señales de comer-me que son reconocidas por los receptores de engulfment de los fagocitos, y son eliminadas por fagocitosis 3 , 4 , 5 , 6 . Así, la fagocitosis desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del huésped, y por lo tanto, elucidar la molécula<html> Los mecanismos subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas son importantes. Los mecanismos responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas parecen ser evolutivamente conservadas entre las especies en los nematodos, moscas y ratones [ 7] . Actualmente se dispone de varios ensayos de fagocitosis para evaluar la absorción de células apoptóticas en estos animales modelo. En C. elegans , 131 células somáticas sufren muerte celular programada durante el desarrollo, y los cadáveres de células son phagocytosed por las células vecinas, que son no fagocitos profesionales [ 8] . Por lo tanto, contar el número de cadáveres de células restantes en C. elegans indica el nivel de fagocitosis in vivo . En la búsqueda de mutantes de nematodos que muestran un mayor número de células muertas, varios genes necesarios para la fagocitosis han sido identificados y caracterizados genéticamente 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Los ensayos de fagocitosis ex vivo con fagocitos de cultivo primario, generalmente macrófagos, se usan a menudo en ratones. Las células apoptóticas se preparan usando líneas celulares tales como células Jurkat, y se mezclan con fagocitos primarios. Después de una incubación durante varias horas, se cuenta el número total de fagocitos y de fagocitos engullantes para evaluar el nivel de fagocitosis. Como una modificación sofisticada de este método, el grupo de Nagata desarrolló un ensayo de fagocitosis ex vivo con células que expresan un ICAD resistente a caspasa (inhibidor de la DNasa activada por caspasa), en el que las células apoptóticas no sufren fragmentación apoptótica del ADN, Las células son fagocitadas. Cuando estas células se usan como dianas apoptóticas en un ensayo de fagocitosis, sólo el ADN de las células apoptóticas engullidas está fragmentado y teñido por marcado de extremos dUTP mediados por TdT (TUNEL). Por lo tanto, el leveL de la absorción de células apoptóticas se mide por el recuento de señales TUNEL en una mezcla de fagocitos y células apoptóticas [ 13] . En D. melanogaster , los fagocitos profesionales denominados hemocitos, los macrófagos de Drosophila , son responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas 14 , 15 . Además de los ensayos de fagocitosis in vitro con líneas celulares de cultivo, se dispone de ensayos de fagocitosis in vivo con embriones enteros de Drosophila . Los embriones de Drosophila son una poderosa herramienta para examinar el nivel de engrosamiento de células apoptóticas debido a que muchas células sufren apoptosis y son fagocitadas por hemocitos durante el desarrollo embrionario 14 , 15 , 16 . Un ejemplo de un ensayo de fagocitosis in vivo es el método desarrollado por el grupo de Franc. En su método, los hemocitos sonProtegido por la inmunotinción de peroxidasina, un marcador de hemocito, las células apoptóticas se tiñen utilizando el tinte nuclear, 7-amino actinomicina D en embriones enteros de Drosophila , y el número de células positivas dobles se cuenta como una señal de fagocitosis 17 . Otro ejemplo de un ensayo de fagocitosis en embriones se basa en el concepto de método de Nagata descrito anteriormente; Sin embargo, la fagocitosis in vivo se evalúa utilizando los embriones de dCAD ( Drosophila caspasa-DNasa activada) moscas mutantes [ 18 , 19] . Estos ensayos de fagocitosis in vivo son útiles para observar directamente la fagocitosis in situ . Sin embargo, las dificultades están asociadas con la exclusión de cualquier sesgo posible en el paso de contar células fagocitosas porque es difícil observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros debido a su grosor. Para superar esta limitación, desarrollamosUn nuevo ensayo de fagocitosis en embriones de Drosophila . En nuestro método, para poder contar fácilmente los hemocitos fagocitados, se homogeneizan embriones enteros para preparar células embrionarias dispersas. Los fagocitos son detectados por la inmunotinción de un marcador de fagocitos, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL con estas células embrionarias dispersas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro que cuantificara con precisión el nivel de fagocitosis. Todos los genotipos de moscas pueden emplearse en este ensayo si se desarrollan hasta la etapa 16 de los embriones 20 , la etapa de desarrollo en la que la depuración de las células apoptóticas por fagocitosis es la más abundante. Este método tiene la ventaja de evaluar cuantitativamente el nivel de fagocitosis y, por tanto, puede contribuir a la identificación de nuevas moléculas implicadas en la fagocitosis de células apoptóticas in vivo .

<table><tbody><tr><td>whole swine serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>For bloking</td></tr><tr><td>Treff micro test tube(easy fit)&amp;nbsp; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>pellet mixer&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>secondary antibody for&lt;br/&gt; stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-&lt;br/&gt; 3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Anti-Croquemort antibody</td><td></td><td></td><td>described previously in Manaka &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anti-GFP&lt;br/&gt; from mouse IgG1&amp;kappa; (clones 7.1 and 13.1)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine&lt;br/&gt; tetrahydrichloride</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Fly Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock center&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock ID&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Control flies, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&lt;sup&gt;&amp;Delta;5&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>drpr mutant, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutant, described in Devenport &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>described in Br&amp;uuml;ckner &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td><td>4833</td><td>-</td></tr><tr><td>UAS-Itgbn-IR</td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

Los mecanismos moleculares subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas necesitan ser aclarados con más detalle debido a su papel en las enfermedades inmunes e inflamables intratables. En este documento se desarrolló un método experimental para investigar la fagocitosis cuantitativamente utilizando la mosca de la fruta Drosophila , en el que la red de genes que controla las reacciones de engulfment se conserva evolutivamente de los mamíferos. Con el fin de detectar con precisión y contando engullir y no engolfar los fagocitos con animales enteros, embriones de Drosophila se homogeneizaron para obtener células dispersadas incluyendo fagocitos y células apoptóticas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro en el que es posible observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros y cuantificar con precisión el nivel de fagocitosis. Se confirmó que este método reproduce los de estudios previosQue identificó los genes necesarios para la fagocitosis de las células apoptóticas. Este método permite analizar la absorción de células muertas y, cuando se combina con la poderosa genética de Drosophila , revelará las complejas reacciones fagocíticas que comprenden la migración, el reconocimiento, el engolfamiento y la degradación de las células apoptóticas por los fagocitos.

Con el fin de examinar la fagocitosis de las células apoptóticas, Drosophila embriones de desarrollo etapa 16 fueron recogidos y preparados como células dispersas. Los hemocitos, macrófagos de Drosophila , se tiñeron por inmunocitoquímica para el marcador de hemocito &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 usando un anticuerpo específico 19 , 21 , y las c?...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

En el presente documento se describe un ensayo de fagocitosis utilizando las células embrionarias dispersas de Drosophila . Nos permite cuantificar con facilidad y precisión los niveles de fagocitosis in vivo , e identificar nuevas moléculas necesarias para la fagocitosis de las células apoptóticas.

Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

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Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

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9.8K vistas.  Kanazawa University.  En el presente documento se describe un ensayo de fagocitosis utilizando las células embrionarias dispersas de Drosophila . Nos permite cuantificar con facilidad y precisión los niveles de fagocitosis in vivo , e identificar nuevas moléculas necesarias para la fagocitosis de las células apoptóticas. 

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurociencias

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biología

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Evaluación de la capacidad fagocítica específica por edad de los hemocitos de Drosophila melanogaster adultos utilizando un ensayo de fagocitosia In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Nazario-Toole, A. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59543">Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a fluorescence microscope.

Un ensayo in vivo para cuantificar la fagocitosis bacteriana en moscas Drosophila adultas

1. Prepare Fluorescein particles for injection

	Reconstitute 10 mg of commercially available, heat-killed bacteria particles labeled with fluorescein ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. <a href="https://app.jove.com/v/56352">Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

El ensayo de fagocitosis: una técnica de inmunotinción para visualizar el envolvimiento de células apoptóticas en las células embrionarias de Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining ...

Técnicas biológicas

Assay Techniques

Cell-based assays

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

Source: Taruc, K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58149">Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Ensayo de eferocitosis de células fijas: un método para estudiar la absorción eferocítica de células apoptóticas por macrófagos mediante microscopía de fluorescencia

Source: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...

Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en

Resumen

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