Este protocolo proporciona una plataforma para estudiar las respuestas de las células CD4T que a menudo son débiles y difíciles de detectar. Esta técnica permite la detección, enumeración y aislamiento de celdas CD4T sin conocimiento previo sobre la presentación de antígenos. La principal ventaja es el análisis de las células CD4T que son poblaciones bastante raras asociadas con enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo uno.
Al obtener la muestra de sangre periférica de un donante sano, diluya la sangre en PBS en al menos una o dos proporciones antes de colocar 35 mililitros de sangre en capas de 15 mililitros de gradiente de densidad medio en un tubo de 50 mililitros. Separe las células por centrifugación de gradiente de densidad y elimine aproximadamente 20 mililitros de la capa plasmática superior resultante. Luego recoger la capa de glóbulos blancos teniendo cuidado para evitar el pellet de glóbulos rojos y lavar las células tres veces en PBS fresco.
Después de contar, diluir las células a una vez 10 a la sexta célula mononuclear de sangre periférica o PBMC por mililitro de concentración de PBS. Agregue 300 microlitros de células para cada control en tubos individuales de 10 mililitros. Después de encabezar cada tubo con PBS, sedimentar las células por centrifugación y resuspender las células en un uno por 10 a las sextas células por mililitro de concentración media RP5.
A continuación, placa 100 microlitros de células por control a cada uno de los tres pozos de una placa de 96 pozos que contiene 100 microlitros de RP5 medio por pozo. Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante siete días. A continuación, transfiera los PBMC restantes a un nuevo tubo de 50 mililitros y agregue un microlitro de solución de material de trabajo CFSE por mililitro de suspensión celular al lado del tubo.
Invierta rápidamente el tubo varias veces para mezclar y colocar las células en una incubadora de cultivo celular durante cinco minutos. Al final de la incubación, detener la reacción con cinco mililitros de medio RP5 y recoger las células por centrifugación. Resuspender el pellet en un solo 10 a los sextos PBMC por mililitro de medio RP5 fresco y añadir un mililitro de células a un tubo de 10 mililitros por antígeno a probar.
A continuación, añadir 100 microlitros de células por antígeno a cada uno de los tres pozos de un pozo de 96 pozos que contiene 100 microlitros de medio RP5 complementado con el antígeno diluido de interés por pozo. Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante siete días. Para manchar las poblaciones de células CD4+T para el análisis citométrico de flujo, al final del cultivo transfiera todo el volumen de células de cada pozo a la clasificación celular activada por fluorescencia individual o a los tubos FACS.
Lave cada muestra con un mililitro de PBS complementado con un suero de ternera fetal al 0,1%o FCS. Resuspender los pellets en un anticuerpo CD4 antihumano apropiado en 100 microlitros de PBS más FCS por tubo. Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 20 minutos protegidos de la luz.
Al final de la incubación, lave las muestras en un mililitro de PBS fresco más FCS por tubo y resuspendir los pellets en 100 microlitros de PBS fresco más FCS. Inmediatamente antes del análisis, agregue un microlitro de yoduro propidium a cada tubo para permitir la exclusión de las células muertas. Puerta de los linfocitos de acuerdo con sus áreas de dispersión hacia adelante y lado.
Para excluir las células apoptóticas, atraque el área de dispersión hacia adelante frente a las células negativas de yoduro propidio y utilice las celdas no manchadas para establecer una línea base de voltaje para las celdas no fluorescentes. Establezca los voltajes para el fluoróforo de anticuerpos CD4 y la señal CFSE para que la señal fluorescente sea inferior a 1000 para cada uno. Utilice las muestras CFSE y CD4 de control de color único para confirmar una señal fluorescente positiva para cada color utilizando los voltajes establecidos con las celdas no manchadas.
Como cfSE y yoduro propidium tienen cierta superposición espectral, ajuste la compensación para restar la fluorescencia de yoduro propidium de la fluorescencia CFSE hasta que la muestra CFSE sólo no produzca una señal en el canal de yoduro de propidium. Una vez analizadas todas las muestras, calcule el índice de división celular dividiendo el número de células divididas por 5000 células no divididas del grupo estimulado por el número medio de células divididas por 5000 células no divididas de las células cultivadas sin antígeno. Casi todos los donantes demuestran una fuerte respuesta de células T al toxoide del tétanos después de la estimulación in vitro porque los donantes han sido vacunados haciendo que el toxoide del tétanos sea un antígeno de control positivo útil.
Sin embargo, la proliferación de células CD4+T a partir de PBMC no estimulados es mínima. Después de siete días de estimulación con péptido C pro-insulina humano, se pueden detectar células CD4+T específicas de pro-insulina C-péptido en la sangre periférica de un individuo con diabetes tipo uno. PbMC estimulado con proteína de matriz de virus de la gripe A también demuestran proliferación.
En conjunto, estos datos demuestran que el ensayo se puede realizar utilizando proteínas de longitud completa, así como péptidos sintéticos cortos. El componente FACS de este método se puede realizar utilizando un citómetro de flujo de clasificación de celdas. Usando un clasificador de células, las células T específicas del antígeno se pueden aislar en el nivel de celda única para el análisis posterior.
Este método ha permitido el descubrimiento de respuestas celulares CD4T en individuos con diabetes tipo uno de inicio temprano. El análisis de estas raras poblaciones de células T utilizando otros métodos presenta varios desafíos técnicos.
