El objetivo principal de este protocolo es utilizar el poder de la genética hacia adelante para identificar genes que cuando se desregulan conducen a la neurodegeneración. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque imparcial y directo para la identificación de genes neuroprotectores que podrían ser más difíciles de realizar en modelos de mamíferos. Esta técnica se puede utilizar para identificar genes nuevos implicados en el proceso de neurodegeneración que se asocia con muchas condiciones de la enfermedad como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
Además de identificar genes neuroprotectores, el enfoque genético hacia adelante se puede utilizar para descubrir genes implicados en otros procesos biológicos como la función neuronal y la transmisión. Para empezar, recoge moscas homocigotas de líneas pertenecientes a la colección mutagenizada ENU de mutantes Drosophila asignados al segundo cromosoma. Voltear las moscas de 10 a 12 días de edad en una cámara de prueba sin anestesia una línea a la vez y permitirles recuperarse durante cinco minutos.
Con la línea de cinco centímetros de lado hacia abajo, toque por la fuerza la cámara tres veces en una almohadilla de ratón colocada en una superficie sólida para que todas las moscas comiencen el ensayo en la parte inferior. Observe la locomoción de la mosca durante un período de 10 segundos. Registre el número de moscas que alcanzan o pasan la línea de cinco centímetros dentro de este tiempo, así como el número total de moscas probadas.
Espere un minuto antes de comenzar un segundo juicio. Repita un mínimo de tres réplicas de prueba por línea. Después de anestesiar las moscas en una almohadilla de dióxido de carbono, corta cabezas de mosca con una cuchilla quirúrgica y usa un pincel para colocarlas suavemente en un mililitro del fijador de Carnoy en un tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitros.
A continuación, guarde el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, asegúrese de que las cabezas estén hundidas en la solución fijativa. Bajo una campana de humo, utilice una pipeta P1000 para reemplazar la solución fijadora por un mililitro de 70% de etanol y mantenga las muestras a cuatro grados Celsius para análisis futuros.
Con una pipeta Pasteur, transfiera las cabezas fijas a casetes de microbiopsía y cierre los cassettes. Envíe los casetes a una instalación de histología para su procesamiento o colóquelos en una máquina de procesamiento de tejidos automatizada si está disponible en el sitio. Ejecutar el programa para deshidratar, limpiar e infiltrarse en las cabezas con parafina.
A continuación, transfiera los cassettes a una estación de incrustación de parafina con parafina calentada a 60 grados Centígrados y coloque moldes base metálicos que ajusten los cassettes en la estación calentada. Utilice fórceps finos para orientar las cabezas de manera que se dirijan a la parte superior del molde base. La orientación adecuada de la cabeza es fundamental para el análisis de histología.
Después del endurecimiento, recorte cada bloque de parafina para minimizar la superficie que se se se le cortará. Corte cinco secciones de micrómetros de cada bloque en el microtoma. A continuación, coloque las cintas de parafina seccionadas en un baño de agua caliente a 35 grados centígrados durante un máximo de cinco minutos.
Sumerja un tobogán recubierto de poli lisina en el baño de agua caliente y utilice un aplicador de madera para colocar las cintas seccionadas en el tobogán. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, usa un calentador de diapositivas para calentar los portaobjetos durante 15 minutos a 63 grados centígrados.
Debajo de una campana de humo, coloque los portaobjetos en un estante de tinción deslizante y coloque el estante en HistoChoice durante cinco minutos dos veces seguido de varios tratamientos de baño de etanol y agua destilada según el manuscrito. Transfiera el estante a un recipiente lleno de Harris Hematoxilin durante dos a cinco minutos para manchar. A continuación, saque el bastidor de la solución de Hematoxilina y colóquelo bajo el agua corriente del grifo durante 10 minutos antes de los siguientes pasos de tinción.
Después de la tinción, utilizando fórceps, saque las diapositivas de la solución HistoChoice o Xileno. Gotee una fina capa de medio de montaje permanente en la muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior. Evitar la formación de burbujas.
Después de endurecer el medio de montaje, coloque la diapositiva bajo un microscopio de luz para obtener imágenes de secciones cerebrales representativas aproximadamente en el cerebro medio. En primer lugar, preparar un alimento que contenga vial para generar moscas hembra heterocigotas. Después de la anestesia de dióxido de carbono, usa un pincel para transferir a cinco machos de la línea mutante y 10 hembras vírgenes del lóbulo atascado esternopleural y pin sobre la línea Curly O en el vial para hacer una cruz.
Coloque el vial a 25 grados centígrados. Después de 10 a 12 días, recoger al menos 15 progenie virgen que lleva el cromosoma mutado y el cromosoma marcador. Cruzarlos a cinco machos de una línea equilibrada que lleva otro marcador dominante visible Curly O sobre scutoid o equivalente.
Después de 10 a 12 días, recoger el progenie macho heterocigoto que lleva ya sea scutoid o Curly O y el cromosoma potencialmente recombinado de la cruz. Aparé individualmente con hembras vírgenes de la población que lleva el cromosoma mutado. De diez a 12 días después, recoger la progenie de la última cruz en nuevos alimentos que contienen viales y envejecer las moscas a 29 grados celsius a 10 a 14 días.
Realizar histología sobre cabezas volantes y repetir para la progenie de cada cruz individual. Con esta información, realice mapeo de deficiencias en la región estrecha del cromosoma para refinar la ubicación de la mutación recesiva. Cada línea de deficiencia tiene una eliminación de diferentes regiones de los cromosomas que les permite ser utilizados para pruebas de complementación.
A continuación, cruce las líneas del kit de deficiencia de Drosophila para el segundo cromosoma y busque la no complementación del fenotipo del interés. Para obtener referencia para el análisis de secuencia de ADN, descargue un archivo de formato FASTA que contenga la secuencia de consenso genómica del gen BRAT de FlyBase o utilice un archivo que contenga resultados para la secuencia BRAT de un control de fondo genético, por ejemplo, la línea Drosophila mutagenizada originalmente. Abra los archivos de secuenciación en el Editor de plásmidos.
Vaya a Editar y haga clic en Alinear secuencias. Con el ratón del ordenador, seleccione todas las secuencias que desee comparar. En el menú desplegable, indique la secuencia de referencia para esta alineación.
Inspeccione la región secuenciada en busca de cambios de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Si lo desea, guarde la alineación en un equipo en formato RTF haciendo clic en Texto y luego en Guardar. Realice el experimento de rescate recogiendo la progenie F1 de cada cruz.
Seleccione cuidadosamente los equilibradores marcados. Envejecer las moscas en Drosophila medio de alimentos en 29 grados Celsius y realizar análisis histología en el cerebro para buscar la neurodegeneración como antes. Para realizar análisis dependientes de la edad de la neurodegeneración en 867 mutantes, envejecer las moscas a cinco, 15 y 25 días y realizar análisis histológicos posteriores.
Este protocolo presenta un enfoque genético hacia adelante para la desparasitación a través de una colección de moscas mutadas químicamente utilizando un ensayo de escalada. Entre 235 líneas homocigotas, alrededor del 37% de las líneas probadas mostraron una tasa de paso de escalada por debajo del 50% cuando se probaron a la edad de 10 a 12 días. La posterior pantalla histológica en 51 de las líneas que presentaban la tasa de paso de escalada más baja reveló que 29 de estas líneas mostraban la apariencia visible de agujeros en la neuropípa cerebral que van desde indicativos leves a graves de neurodegeneración.
El fenotipo de neurodegeneración en 867 moscas es recesivo porque los cerebros de las moscas heterocigotas 867 que han sido tachadas a una cepa de tipo salvaje eran comparables a los de los controles. La línea de deficiencia Df24116 no complementa el fenotipo mutante 867 basado en el ensayo de escalada. La verificación histológica muestra que la línea de deficiencia Df24116 no complementa el fenotipo de neurodegeneración 867, mientras que Df9296 sí.
El examen del fenotipo cerebral de 867 mutantes cruzados a líneas de deficiencia adicionales confirmó que la mutación está contenida en la región del genoma que incluye el gen BRAT. Es importante recordar durante este procedimiento trabajar de la forma más rigurosa y precisa posible, ya que este protocolo combina varios pasos que si se ejecutan incorrectamente pueden afectar a la identificación de mutantes con neurodegeneración en genes candidatos. Dependiendo de los genes identificados, el análisis posterior puede incluir la prueba de óvulos adicionales del gen del interés o interacciones con genes que juegan un papel en vías conocidas de neurodegeneración.
Durante el procedimiento de histología, recuerde manejar la solución fijadora de Carnoy con precaución ya que contiene cloroformo. Use guantes y use con una ventilación adecuada idealmente debajo de la campana de humos. Del mismo modo, realizar toda la tinción histológica bajo la campana de humos.
