Damos las gracias a Leo Pallanck para las poblaciones de moscas, Christine Sommers de asistencia técnica y Gerasimos P. Sykiotis útil para los debates. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención T32CA009363 formación de MCB

1. Sobresalto inducida Ensayo geotaxis Negativo <ol><li> Seleccione moscas del genotipo deseado, separarlos por sexo, grupo al azar en las cohortes de 20 a 30 animales y voltear en nuevos frascos de alimentos cada 2-3 días, las pruebas de cada conjunto de moscas (es decir, las cohortes de edades similares, una cohorte / genotipo) al menos una vez a la semana. </li><li> Treinta minutos antes de la prueba geotaxis negativa, anestesiar a las moscas con CO 2 y colocarlos en pre-etiquetados tubos de plástico transparentes hechos con dos frascos vacíos de alimentos (véase la Tabla de Materiales) unidas por sus aberturas con cinta adhesiva transparente (dimensiones de la cámara de 19 cm x 2,85 cm). En nuestras pruebas usamos normalmente 25 moscas / tubo. Nota. El tiempo de recuperación de la anestesia puede variar desde unos pocos minutos a varias horas (por ejemplo, S / N) y debe ser optimizado para los genotipos específicos ensayados. </li><li> Marque diferentes alturas (de 1 a 20 cm) en una hoja de papel secante y cinta el papel sobre una superfi verticalese, perpendicular a la banca. </li><li> Colocar los tubos en primera plana del periódico: los tubos deben estar alineados y tan cerca como sea posible del papel para permitir la medición de altura exacta. </li><li> Coloque la cámara digital (ver la tabla &quot;Equipo Especial&quot;) delante de los tubos, a una distancia de 20-30 cm del papel, en un soporte (por ejemplo, una caja de puntas de pipeta), seleccione la opción &quot;película&quot; y empezar a grabación, en este momento también se debe iniciar un temporizador para realizar un seguimiento del tiempo entre ensayos consecutivos. </li><li> Permitir que las moscas para recoger en la parte inferior del tubo golpeando ligeramente el tubo de pocos segundos (por ejemplo, 10 segundos). Este paso se debe realizar constantemente (es decir, misma duración, la misma fuerza, el mismo operador) durante todo el experimento. </li><li> Movimientos Registro moscas con la cámara digital de 10 seg. </li><li> Repita los pasos 1.5 a 1.7 catorce veces a intervalos de un minuto. </li><li> Analizar los datos: <ol type="a"><li> Cuente el número de moscas que están por encima de la2 marca cm después de 10 segundos por inspección visual de las películas grabadas. Nota: En las condiciones de ensayo geotaxis comportamiento negativo de las moscas no duró más allá de los primeros 10 segundos después de la sorprendente (por ejemplo, las moscas empezaron a moverse en todas las direcciones 10 segundos después de asustarlos). La distancia mínima subió por las moscas de control (es decir, 1 semana de antigüedad moscas que expresan el conductor THGal4, véase la leyenda de la figura 1) en esta ventana de tiempo fue de 2 cm. Por lo tanto, se utilizó la marca de 2 cm como referencia para el análisis de las actividades de escalada de moscas de diferentes edades y genotipos 10 segundos después de iniciar el comportamiento. Estos parámetros pueden requerir el ajuste para tener en cuenta las diferencias en el comportamiento de las moscas a prueba (por ejemplo, debido a los diferentes antecedentes genéticos o las condiciones de laboratorio). Observe que en nuestras condiciones de ensayo, todos los genotipos probados realiza peor o similar a las moscas del genotipo control. </li><li> Tomar la media de los resultados de los quinceensayos. </li><li> Promedio Express como un porcentaje del número total de moscas en el tubo (= actividad de escalada%); el número de repeticiones (N) viene dado por el número de cohortes independientes ensayadas para cada genotipo </li><li> Evaluar la significación estadística entre los diferentes genotipos en el tiempo. Esto se puede lograr con la prueba de la t de Student (cuando se comparan dos genotipos) o un análisis de 2 vías ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni post hoc (cuando se realizan comparaciones múltiples) utilizando softwares comerciales tales como GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, EE.UU.). </li></ol></li></ol> Nota Llevamos a cabo todos nuestros ensayos al mismo tiempo del día, a TA y bajo las mismas condiciones de luz. Mantener las moscas en un entorno de ciclo de 12 horas de luz / oscuridad es aconsejable controlar el efecto de los ritmos circadianos en el comportamiento locomotor de las moscas. 2. Inmunofluorescencia tirosina hidroxilasaEnsayo de Montes Whole Brain Soluciones y tampones Solución de fijación: 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) Tampón de lavado: 0,1% de Triton X-100 en PBS El tampón de bloqueo: 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 y 0,5% de BSA Medios de montaje: Mowiol-DABCO (ver protocolo descrito en Harlow E, Lane D., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratorios Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., 10:418 (1988)) Procedimiento <ol><li> Ponga moscas en una placa de disección lleno de 70% de EtOH durante aproximadamente 1 min para eliminar la cera de la cutícula. </li><li> Transferencia vuela a otro plato de disección llena de helado de PBS. </li><li> Disección del cerebro: <ol type="a"><li> Coloque la marcha con el costado ventral (opcional: las alas y las piernas quitar). </li><li> Tire de la cabeza del cuerpo: utilice un conjunto de pinzas paraaferrarse al cuerpo y otro para aferrarse a la cutícula bajo la mirada para no dañar el cerebro </li><li> Retire la probóscide. </li><li> Espera a la cabeza de la cutícula en lados opuestos de la ranura izquierda abierta después de la eliminación de la trompa y tirar en direcciones opuestas hasta que el cerebro se elimina de la cápsula de la cabeza. </li><li> Retirar toda la cutícula del cerebro. </li><li> Quite todo el tejido traqueal lleno de aire, lo que evitará que el cerebro flotando en las siguientes etapas de incubación. </li></ol></li><li> Cortar unos milímetros de la punta de la punta de la pipeta P-200 y se equilibra con una solución al 0,1% de Triton X-100/PBS </li><li> Uso del preparado punta P-200 pipeta, transferir los cerebros a un tubo Eppendorf de 0,5 ml lleno con 0,5 ml de PFA al 4% / PBS y mantener en hielo hasta la disección es completa. </li><li> Fijar el cerebro a temperatura ambiente durante 20 min: aplicar una rotación suave, poniendo los tubos Eppendorf en un rack y colocar el bastidor en una nutator. </li><li> Quite el fijadorel uso de un P-1000 micro pipeta, añadir 0,5 ml de 0,1% Triton X-100/PBS, mezclar por inversión y dejar incubar durante 1 min; repetir este paso de lavado una vez. </li><li> Retire el buffer del segundo lavado, añadir 0,5 ml de 0,1% Triton X-100/PBS y dejar incubar a temperatura ambiente durante 20 min, repita este paso dos veces. </li><li> Retirar el tampón de lavado y dejar que los cerebros se incuban en tampón de bloqueo (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 y 0,5% de BSA) durante 1 hora a TA. </li><li> Incubar el cerebro con una dilución 1:100 de anticuerpo anti-TH (vea la &quot;Tabla de reactivos específicos&quot;) en solución de bloqueo, durante dos días, a 4 ° C, con una rotación suave (vea el paso 2.6.). </li><li> Repita los pasos de lavado 2.7. y 2,8 .. </li><li> Equilibrar los cerebros con una dilución 1:200 de solución de bloqueo antibodyin secundaria, durante dos días, a 4 ° C, con rotación suave. </li><li> Repita los pasos de lavado 2.7. y 2,8 .. </li><li> Preparar los portaobjetos de montaje como se ilustra en la Figura 2A: <ol type="a"><li> Ladd 2 X 25 l gotas de medio de montaje a una cubierta de vidrio (24 x 60 mm,. no 1.5). </li><li> Coloque dos cubiertas de vidrio (tamaño 18 x 18 mm,. N º 2) en el soporte de montaje, dejando un hueco en el centro de la diapositiva y dejar secar. </li></ol> Nota. Compruebe el soporte de la muestra en el escenario de su microscopio confocal. Puede hacer que el vidrio de cubierta del mismo tamaño de un x 75 mm diapositiva 25 uniendo un x 22 mm 1,5 vidrio de cubierta 22 a uno de los extremos (utilizar esmalte de uñas y cinta). </li><li> Eliminar el tampón de lavado, se añaden 50 l de medio de montaje y permitir que los cerebros se equilibren con él la pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> El uso de un corte P-200 punta de pipeta (véase el paso 2.4) transferir los cerebros a la diapositiva en el espacio entre los dos cubreobjetos y cubrir con un cubreobjetos no. 1.5 (véase la figura 2, para orientar a los cerebros de la diapositiva ver 7). Nota: las muestras se montan entre dos cubiertas de vidrio para permitir la visualización tanto de la anterior y el posterior lado del cerebro. </li><li> Llenar todo el espacio entre los cubreobjetos con medio de montaje; pipeta de una esquina a eliminar todo el aire, dejar secar y sellar con esmalte de uñas. </li><li> Para evaluar el número de neuronas dopaminérgicas en un grupo específico adquirir una serie de secciones ópticas a lo largo del eje z con un paso de tamaño 1,0 micras usando un microscopio confocal (para la identificación anatómica de las agrupaciones dopaminérgicas en el cerebro adulto de Drosophila ver 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

Declaramos que no tenemos intereses financieros en competencia.

Los ensayos descritos aquí proporcionar un enfoque útil para estudiar la función de genes específicos, las vías de señalización o compuestos pequeños en el mantenimiento de las neuronas DA en el envejecimiento, así como en diferentes bases genéticas de enfermedades vinculadas (revisado en 5). El comportamiento negativo de sobresalto geotaxis inducida de Drosophila se ha usado ampliamente como un funcional de lectura para la funcionalidad de las neuronas DA en di...

La especificidad de los ensayos descritos aquí se basa en el uso de una línea de la mosca Gal4 que explota las secuencias reguladoras del gen de la tirosina hidroxilasa para lograr la expresión específica en las neuronas dopaminérgicas 3. La tirosina hidroxilasa cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la síntesis de dopamina. TH inmunoreactividad en los adultos se superpone cerebro de la mosca con la de la dopamina, lo que hace TH un buen candidato para identificar las neuronas DA in vivo (véase, por ejemplo 6). Por otra parte, el patrón de expresión de THGal4 es más específico que el de otras líneas de Gal4 como DdcGal4, que contiene secuencias reguladoras del gen de la dopa decarboxilasa y conduce la expresión transgénica no sólo en las neuronas DA, sino también en las neuronas serotoninérgicas y subconjuntos de células gliales 3 . Feany y Bender (2000) observaron por primera vez que la expresión de pan-neuronal del gen de la α-sinucleína humana DP-ligado acelera la pérdida progresiva de la estacióncomportamiento rtle inducida geotaxis negativa en Drosophila. Hemos observado resultados similares usando la línea específica de neuronas DA THGal4 para conducir la expresiónde la α-sinucleína transgén 10 y utilizado esta funcionalidad de lectura para estudiar el papel neuroprotector de la vía Nrf2 en este Drosophila modelo de la EP 14. El ensayo específico que se describe aquí es una adaptación de 2 y 3. El cerebro de Drosophila contiene más de 100 neuronas DA, dispuestos en al menos 5 grupos diferentes (pPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) que se pueden visualizar en montajes de todo el cerebro por microscopía confocal (véase, por ejemplo 11 y 7). Es todavía es controvertido si o no el número de neuronas DA en el cerebro disminuye Drosophila con 9 años de edad, 11, sin embargo, la neurodegeneración dependiente de la edad se observó en las moscas que se han mutado genes PD-enlazadas / sobreexpresa para modelar enfermedades humanas5. La expresión de humano α-sinucleína en las neuronas DA tiene tal efecto y, por lo tanto, se ha utilizado como un modelo para la EP. A continuación se describe un ensayo para las neuronas DA cuentan en todo el cerebro se monta utilizando TH como marcador celular. Este ensayo ha sido adaptado de 13 y 10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster es una valiosa organismo modelo para estudiar el envejecimiento y los procesos patológicos degenerativos en el sistema nervioso. Las ventajas de la marcha como un sistema experimental incluyen su maleabilidad genética, vida corta y la posibilidad de observar y analizar cuantitativamente comportamientos complejos. La expresión de los genes vinculados a la enfermedad en poblaciones neuronales específicas del cerebro de Drosophila, se puede utilizar para modelar enfermedades neurodegenerativas humanas como el Parkinson y el Alzheimer 5. Las neuronas dopaminérgicas (DA) se encuentran entre las poblaciones neuronales más vulnerables en el envejecimiento del cerebro humano. En la enfermedad de Parkinson (PD), el trastorno del movimiento más común neurodegenerativa, la pérdida acelerada de neuronas DA conduce a una disminución progresiva e irreversible de la función locomotora. Además de la edad y la exposición a las toxinas ambientales, la pérdida de las neuronas DA se ve agravada por las mutaciones específicas en la codificacióno regiones promotoras de varios genes. La identificación de tales alelos asociada a la EP proporciona la base experimental para el uso de Drosophila como modelo para estudiar la neurodegeneración de las neuronas DA in vivo. Por ejemplo, la expresión del gen humano α-sinucleína PD-vinculados en Drosophila neuronas DA recapitula algunas características de la enfermedad humana, por ejemplo la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas y la disminución de la función locomotora 2. En consecuencia, este modelo ha sido utilizado con éxito para identificar posibles dianas terapéuticas en la EP 8. A continuación se describen dos ensayos que habitualmente se han utilizado para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas DA en Drosophila: un ensayo de escalada en base a la respuesta de sobresalto inducida geotaxis inmunotinción negativa y la tirosina hidroxilasa de todo el cerebro adulto monta para controlar el número de neuronas DA en las diferentes edades. En ambos casos, la expresión in vivo de t UASransgenes específicamente en las neuronas DA se puede lograr mediante el uso de una tirosina hidroxilasa (TH) de la línea controlador promotor Gal4-3, 10.

Hemos utilizado los ensayos descritos aquí para estudiar el papel de la vía Nrf2 protectora estrés en un modelo de Drosophila de la EP 14. Este modelo se basa en la expresión del gen de la α-sinucleína humana en las neuronas DA utilizando un TH Gal4 conductor 2, 10. La Figura 1 muestra un resultado representativo de un geotaxis negativos inducidos por sobresalto (escalada) de ensayo en las moscas macho que expresan diferentes transgenes b...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA) en<em&gt; Drosophila</em&gt;: La escalada / ensayo geotaxis negativo sobresalto inducida que permite estudiar los efectos funcionales de las neuronas DA degeneración y la inmunomarcación tirosina hidroxilasa, que se utiliza para identificar y contar las neuronas DA en montajes de todo el cerebro.

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K vistas.  University of Rochester Medical Center. A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA) en Drosophila: La escalada / ensayo geotaxis negativo sobresalto inducida que permite estudiar los efectos funcionales de las neuronas DA degeneración y la inmunomarcación tirosina hidroxilasa, que se utiliza para identificar y contar las neuronas DA en montajes de todo el cerebro.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Investigación

Neurociencias

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Los ensayos olfativos para modelos de ratón de Enfermedades Neurodegenerativas

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La neurogénesis en la evaluación primaria<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones Usando Inmunoticción

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.