Implementamos microCT con ácido fosfotúngstico para mejorar el contraste de tejido blando en la investigación no invasiva del ligamento de retención de orbicularis humanos, una estructura delicada dentro del área de la órbita. Este protocolo ha sido optimizado para ayudar a los investigadores en la investigación no invasiva de tejidos blandos humanos y es fácil de realizar con una cantidad razonable de gastos. Para obtener las muestras, utilice primero un lápiz de color para indicar el área de corte en la piel para la recolección de la muestra.
Confirme que la línea marcada se extiende medialmente a un campus medial, lateralmente a un campus lateral, superiormente a un borde superior del párpado inferior, e inferiormente a un centímetro por debajo de la línea del borde orbital. A continuación, usa una cuchilla para cortar los tejidos faciales a lo largo de la línea marcada, asegurándote de que el corte sea lo suficientemente profundo como para que la punta de la hoja toque el hueso. La muestra cosechada debe incluir la piel, el tejido subcutáneo, el músculo, la grasa y el periosteo.
Tras la recolección, fije inmediatamente la muestra en 10% de formalina durante cinco a siete días a temperatura ambiente. Al final del período de fijación, corte la muestra en tres piezas de cinco a siete milímetros de espesor. Utilice una aguja y un hilo negro para coser el lado superolateral de cada muestra de manera que la dirección de la muestra se pueda determinar en puntos de tiempo posteriores.
Deshidratar la muestra en una serie de concentración ascendente de etanol durante un día por concentración, dejando las muestras en la solución de etanol al 70% hasta que se estén manchando. Una semana antes de que se programe la tomografía por microcomputadora, agregue 2,1 gramos de PTA a 210 mililitros de 70% de etanol y coloque la solución en una coctelera en 55 a 60 rotaciones por minuto. Prepare tres recipientes de plástico de 70 mililitros para cada pieza en rodajas.
Cuando el tinte se haya disuelto en la solución de alcohol, llene los recipientes con la solución. Coloque una muestra en cada recipiente de 1%PTA y agite las muestras a 55 a 60 rotaciones por minuto durante cinco a siete días. Una vez completada la tinción, almacene las muestras en un 70% de etanol fresco durante una semana para preparar el escaneo.
Para el escaneo microCT, envuelva las muestras en Parafilm para evitar el secado y coloque una muestra en la bandeja del escáner. Establezca el voltaje de origen del escáner en 70 kilovoltas, la corriente de origen en 114 microamperios, el filtro de aluminio en 0,5 milímetros, el tamaño de píxel de imagen en 20 micrómetros cuadrados, los píxeles a 2, 240 por 2, 240, la exposición a 500 milisegundos y el paso de rotación a 0,3 grados. A continuación, inicie el análisis.
Una vez finalizada la exploración, abra el software de reconstrucción y seleccione Acciones y Abrir conjunto de datos para iniciar los archivos escaneados. Seleccione la pestaña Configuración y establezca la reducción de los artefactos de anillo en siete y la corrección de endurecimiento de viga. Para comenzar la reconstrucción, seleccione Inicio.
Los datos finales se almacenarán en la carpeta designada. Al final de la reconstrucción, abra el software de cambio de tamaño de archivo y seleccione Conjunto de datos de origen para iniciar los archivos reconstruidos. Seleccione jpg en la pestaña Conjunto de datos de destino y seleccione la opción Cambiar el tamaño 1/2 con la opción Calidad de Sin interpolación A continuación, ajuste la barra de diapositivas a 100 en la pestaña Compresión de imagen e inicie la conversión.
Para la reconstrucción 3D, abra el software de representación de volúmenes 3D y seleccione Acciones y Cargar datos de volumen. Para ajustar el brillo y el nivel de contraste, modifique la función de transferencia de forma en el histograma en la pestaña Editor de funciones de transferencia. A continuación, seleccione Opciones e Iluminación y seleccione los iconos Sombras e Iluminación de superficie para lograr un tono de modelado realista.
Haga clic y arrastre, y haga clic con el botón derecho y arrastre para mover y girar la imagen 3D para encontrar la mejor vista, desplazándose para acercar o alejar como desee. Haga clic en Mayús y arrastre para deslizar el lugar para ver las imágenes seccionales. Encienda el icono Luz y ajuste la barra de indicación de iluminación para encontrar la mejor iluminación para ver, luego apague el icono Luz y cierre la pestaña Iluminación.
En la pestaña Opciones, seleccione Mostrar y recortar cuadro para ocultar el cuadro de la imagen final. A continuación, seleccione Acciones y Guardar imagen para almacenar la imagen. Esta reconstrucción detallada del ORL se logró mediante microCT con la preparación de la PTA como se demostró, permitiendo la visualización de una estructura fibromuscular ligamentosa que se extendía oblicuamente entre la dermis y el periosteum.
En la vista coronal, la cantidad y complejidad de las fibras aumenta lateralmente. En vista horizontal, se observa una malla elaborada con una formación arbórea. En la vista sagital, los espesores de las fibras ORL disminuyen de manera inferior.
En general, esta observación multidireccional demuestra que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas con variaciones en el número y grosor de las fibras dependiendo de su ubicación. Cuando la duración de la tinción es insuficiente en comparación con el volumen de una muestra, la imagen final puede incluir un agujero vacío en la zona central de la muestra. Otros agentes al lado de la PTA se pueden utilizar y diferentes agentes tienen diferentes méritos o características de tinción intereses.
Por lo tanto, es útil optimizar la región de tinción de acuerdo con su experimento.
