Este método le permitirá generar imágenes histológicas tridimensionales a partir de pequeñas muestras de escala milimétrica, incluidos pequeños organismos modelo. La principal ventaja de esta técnica es que las muestras incrustadas son muy estables, lo que le permite mantener las muestras durante largos períodos de tiempo e imágenes de ellas varias veces, por ejemplo, con diferentes métodos de imagen a lo largo de los años. La salida de este método será muy útil para el fenómico del sistema modelo de alto rendimiento, la toxicología y potencialmente incluso el diagnóstico de tejido humano.
Generalmente los individuos nuevos en este método lucharán porque las muestras son relativamente pequeñas y difíciles de orientar o maniobrar. La demostración visual es fundamental porque se requiere atención para evitar daños en la muestra. Para el cecaro juvenil o más viejo, muérdalos de hambre durante al menos 24 horas con el fin de reducir el volumen de contenido intestinal antes de la fijación.
Mueva 10% de formalina tampón neutro o NBF y 2x Tricaine-S pre-enfriado a cuatro grados centígrados sobre hielo. Doble el volumen de agua de pescado con frío 2x MS-222 para una eutanasia rápida y humana. Sesenta segundos después de que los peces hayan dejado de moverse, después de la eutanasia humana, coloque el pescado en solución fría de 10%NBF en viales de vidrio de fondo plano a temperatura ambiente, y fíjelos durante la noche.
En el segundo día, enjuague los especímenes de pescado fijo tres veces en 1x pH PBS 7.4 durante 10 minutos cada uno. Después del lavado, sumerja las muestras en 35% etanol e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, repita este paso con 50%etanol.
Incubar las muestras en ácido fosfotúnte recién preparado 0.3%o solución PTA durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave para mancharlas. Comience el tercer día preparando una mezcla uno a uno volumen por volumen de 100% etanol y resina acrílica blanca LR. Enjuague las muestras tres veces en 70%etanol durante 10 minutos cada una, luego incubar las muestras en 90%etanol a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación suave.
Repita la incubación en las mismas condiciones pero 95%etanol y luego dos veces más con 100%etanol. Al final, sumerja las muestras en una a una mezcla de etanol y resina acrílica blanca LR, e incubar a temperatura ambiente durante la noche con agitación suave. Al cuarto día, retire la mezcla del vial y agregue resina blanca 100%LR para sumergir las muestras.
Incubar durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave. Después de dos horas, sustituya la resina por resina blanca fresca 100%LR, e incubar durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave. Para ensamblar el aparato de incrustación, utilice el tubo de poli MI con un diámetro de al menos 0,1 milímetros mayor que el diámetro de la muestra, y córtalo a una longitud estándar de 30 milímetros.
A continuación, conecte un cabezal de microtubo P1000 al extremo blanco del adaptador de incrustación e inserte el tubo poly MI en su extremo estrecho. Después de que las muestras hayan incubado durante una hora en resina blanca 100%LR, transfiéralas a un pequeño bote de pesaje y sumérgelas completamente en resina blanca 100%LR. Apunte el tubo del aparato de incrustación en el extremo ancho de la muestra fija, o hacia la cabeza, y pipetee la muestra lentamente en el tubo.
Coloque la muestra en el centro del tubo, asegurándose de que el tubo por encima y por debajo de la muestra esté lleno de resina. Inmediatamente después, para sellar el extremo abierto del tubo, aplanar un pedazo de arcilla de modelado suave a base de aceite en una hoja de aproximadamente un milímetro de espesor y estabilizar el tubo entre los dedos índice y medio. A continuación, presione lentamente la arcilla contra el extremo del tubo con el pulgar, y retire cualquier exceso de arcilla.
Retire el aparato de incrustación del cabezal del microtubo. Extraiga el tubo por rotación suave. Mientras sostiene un dedo contra el extremo sellado para evitar la expulsión de la arcilla, selle el otro extremo empujando lentamente el extremo sin sellar del tubo en la arcilla.
Coloque el tubo horizontalmente en un estante de tubo, y deje que la resina se polimerice durante 24 horas a 65 grados centígrados en el horno. Al final del día siguiente, recoja las muestras para la adquisición de imágenes. Una larva de pez cebra incrustada con éxito no tiene burbujas de aire atrapadas.
Si el aire queda atrapado durante el proceso de incrustación, puede moverse hacia la muestra si la muestra no se coloca horizontalmente durante la polimerización, lo que puede degradar la calidad de la imagen. Este protocolo tuvo éxito en la incorporación de varios organismos modelo. Como el pez cebra, Drosophila, Daphnia, y embrión de ratón.
La inserción exitosa se puede mostrar con renderizaciones 3D reconstruidas, imágenes mediante escaneo de micro-CT para peces cebra, Daphnia y Drosophila. La resina de incrustación se puede ver en todos los escaneos fuera de la muestra, pero no interfiere con la muestra en sí. Estos especímenes pueden almacenarse durante un período prolongado de tiempo y reutilizarse para múltiples sesiones de imagen, como se muestra con la larva de pez cebra imagenada en 2011.
Y luego de nuevo en 2013. Las características anatómicas se conservan después del almacenamiento, como se ve en los primer planos de los músculos de ambas exploraciones. Además, los perfiles de intensidad normalizados a sus promedios correspondientes a lo largo de líneas segmentadas, muestran picos locales que coinciden espacialmente en ambos escaneos.
Los valores de intensidad media para las regiones seleccionadas en ambos escaneos se dividieron por un promedio para el fondo y se utilizaron para generar relaciones señal-ruido, que correspondían bien entre los escaneos. Al intentar este método, es importante trabajar suavemente para evitar daños en la muestra y trabajar cuidadosamente para evitar la introducción de burbujas de aire. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la histología o la microscopía electrónica para estudiar patrones de expresión de proteínas, o lograr una mayor resolución de las regiones de interés en 2D.
Esperamos que esta publicación le ayude a acceder al poder del micro-CT de tejido de alta resolución.
