Este protocolo para determinar el tamaño de la cría y la viabilidad embrionaria es utilizado por muchos laboratorios de C.elegans. Las disminuciones en el tamaño bruto y la viabilidad embrionaria pueden indicar defectos en procesos de desarrollo importantes como la miosis, la fertilización y la embriogénesis. Esta técnica proporciona instrucciones claras para los investigadores novatos de C.elegans.
Es relativamente simple de configurar y ejecutar, y es un gran punto de partida cuando se trabaja con nuevas cepas mutantes. El mayor desafío para esta técnica es la identificación de embriones versus embriones no fertilizados. Los nuevos investigadores deben practicar la identificación de embriones, ovocitos y las diferentes etapas larvales antes de comenzar estos experimentos.
Para comenzar, etiquete la parte posterior de la placa, transfiera un hermafrodita individual de la etapa L4 a la placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. Permita que los gusanos se conviertan en adultos y se autoprogenien durante 24 horas a la temperatura de cultivo estándar de 20 grados centígrados.
Anota el plato en el tercer día. Al día siguiente, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera el día un gusano individual a la nueva placa. Permita que los gusanos pongan embriones durante 24 horas a 20 grados centígrados.
Anota el plato en el cuarto día. En el tercer día, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera los gusanos individuales del día dos a la nueva placa. Permita que los gusanos pongan progenie durante 24 horas a 20 grados.
Anota el plato en el quinto día. Dibuje un patrón de cuadrícula en una tapa de 35 milímetros usando un marcador fino. Coloque la tapa cuadriculada debajo de la placa de prueba para contar y realizar un seguimiento de los gusanos contados anteriormente.
Usando un contador de células diferenciales, cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados dentro del cuadrado individual. Para los gusanos en los bordes cuadrados, cuente según la ubicación de la cabeza del gusano. Cuenta gusanos con cabezas tocando los bordes superior e izquierdo del cuadrado.
Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio. En el cuarto día, anote la placa del día dos contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. En el quinto día, marque la placa del día tres contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados, y regístrelos en un cuaderno de laboratorio.
Después de etiquetar la parte posterior de la placa, transfiera un gusano hermafrodita L4 individual a la placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. Transfiera un solo gusano macho L4 a la placa que contiene un hermafrodita L cuatro.
Permita que los gusanos se apareen y pongan descendencia durante 24 horas a 20 grados centígrados. Puntúe la placa para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el tercer día. Al día siguiente, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera el hermafrodita y el macho a la nueva placa.
Asegúrese de que el hermafrodita ha alcanzado la edad adulta. Permita que los hermafroditas pongan descendencia durante 24 horas a 20 grados centígrados. Puntúe la placa para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el cuarto día.
En el tercer día, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera el hermafrodita y el macho a la nueva placa. Permita que los gusanos pongan progenie durante 24 horas a 20 grados. Puntúe el plato para embriones vivos versus no eclosionados en el quinto día.
Usando un contador de células diferenciales, cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados desde el primer día y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. En el cuarto día, cuente la progenie viva y los embriones no eclosionados desde el plato del día dos y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. Verifique el plato del día uno para hombres.
Si se ha producido el apareamiento, la proporción genética esperada de hermafroditas a machos es de 50 a 50. Si la placa del día uno no contiene machos, no se produjo apareamiento entre el macho y el hermafrodita. Descarte este par de apareamiento y registre la observación en el cuaderno de laboratorio.
En el quinto día, cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados del plato del día tres y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. El ensayo de viabilidad embrionaria para N2 arrojó un porcentaje de viabilidad del 98,9%, mientras que tanto him-5 (e1490) como spo-11 (ok79) mostraron una reducción en la viabilidad embrionaria con un porcentaje de 74,9% y 0,8% respectivamente. Se determinó que el tamaño promedio de cría de N2, him-5 (e1490) y spo-11 (ok79) era 217, 105 y 219 respectivamente.
El reconocimiento de las diversas etapas del desarrollo de C.elegans es importante para obtener datos precisos y reproducibles. Recomendamos familiarizarse con el desarrollo de gusanos utilizando imágenes y un microscopio de disección. Este procedimiento es un gran primer paso para determinar si un gen está involucrado en un proceso de desarrollo y puede ser seguido por análisis citológicos para determinar qué proceso se interrumpe.
