El protocolo de reconstitución y fusión detallado aquí es una manera eficiente de estudiar las proteínas unidas a la membrana en un modelo de bicapo lipídica y mezcla de lípidos por proteínas de fusión. Aquí describimos una reconstitución asistida por detergente de Drosophila atlastin recombinante, una proteína de fusión de ER, en liposomas de fosfatidilcolina preformados. La fusión de los proteoliposomas de atlastina se mide mediante un ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET.
Una de las principales ventajas de la reconstitución asistida por detergente es que la proteína del detergente no está expuesta al secado ni a los disolventes. También mostramos aquí que la orientación de la reconstitución de la atlastina es muy eficiente. Otra ventaja del ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET es que los liposomas no necesitan ser cargados con ningún tinte, y no hay necesidad de ningún paso de dialios adicionales.
Para comenzar este procedimiento, prepare las existencias de mezcla de lípidos en cloroformo, como se describe en el protocolo de texto. Añadir una microcurie por mililitro de DPPC a las mezclas de lípidos, asegurándose de reservar al menos ocho microlitros de este stock. Transfiera la cantidad deseada de las mezclas de lípidos en tubos de vidrio de sílex.
Luego seque las mezclas de lípidos bajo una corriente suave de gas nitrógeno durante aproximadamente 10 minutos hasta que no se visible más cloroformo. Seque aún más la película lipídica resultante en un desecador aspirando durante 30 minutos. Después de esto, añadir suficiente A100 con 10%glicerol, dos mililitrolares 2-mercaptoetanol, y un EDTA milimolar a la película lipídica para llevar la concentración de nuevo a 10 milimolar.
Resuspender la película de lípidos por vórtices ligeramente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Congela los lípidos hidratados en nitrógeno líquido. Para descongelar los liposomas, deje que la solución se siente a temperatura ambiente durante 30 segundos, luego transfiéralas de nuevo al agua para una descongelación más rápida.
Repita este ciclo de congelación y descongelación un total de 10 veces. Después de esto, utilice un mini-extrusor para pasar los lípidos a través de filtros de policarbonato, con un tamaño de poro de 100 nanómetros, 19 veces. Para determinar la concentración total de lípidos de los liposomas, añadir cuatro microlitros de lípido y lisosomas a tres mililitros de cóctel de centelleo.
Mida el promedio de recuentos por minuto para stock y liposomas, y calcule la concentración de liposomas, como se describe en el protocolo de texto. Almacene los liposomas a cuatro grados centígrados durante una semana. En primer lugar, mezcle la cantidad adecuada de tampón, detergente adicional y proteína en un tubo de 0,5 mililitros, como se describe en el protocolo de texto.
Añadir rápidamente los liposomas, e inmediatamente vórtice durante cinco segundos para homogeneizar la mezcla. Incubar la reacción en un nutator a cuatro grados centígrados durante una hora. Durante esta incubación, pesar 0,2 gramos de perlas adsorbentes de poliestireno y transferirlos a un tubo de microcentrífuga.
Agregue un mililitro de metanol al tubo y mezcle durante un minuto para desgasar las cuentas. Luego, aspirar el metanol con una aguja de calibre 21 o superior. Para comenzar a lavar las cuentas, agrégueles agua.
Deje que las cuentas se mezclen con el agua durante cinco minutos, luego aspire el agua. Repita este proceso de lavado de agua cuatro veces. Después de esto, añadir agua para llevar la loda de perlas adsorbentes de poliestireno a un volumen de un mililitro, con una concentración final de 0,2 gramos por mililitro.
Calcular la cantidad de perlas adsorbentes de poliestireno necesarias para absorber todo el detergente de cada muestra, como se describe en el protocolo de texto. Cortar una punta de pipeta para recoger la suspensión de cuentas. Transfiera la cantidad calculada de lodo de cordón a un tubo de 0,5 mililitros y aspire el agua.
Agregue las muestras al tubo que contiene las perlas e incubar en un nutator a cuatro grados centígrados durante una hora. Transfiera las muestras a un tubo fresco que contenga nuevas cuentas, asegurándose de dejar las cuentas viejas detrás. Incubar de nuevo utilizando las mismas condiciones.
Repita este proceso de transferencia e incubación de las perlas dos veces. Después de esto, transfiera la muestra a un nuevo tubo que contenga cuentas frescas e incubar por la noche a la mañana a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la muestra de las perlas y la centrífuga a 16.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar los agregados de proteína insoluble.
Recuperar el sobrenadante, y determinar la concentración final de lípidos por conteo de centelleo líquido, como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, lleve los proteoliposomas donantes y aceptadores a una concentración de 0,15 mililitros cada uno en A100 que contenga glicerol, beta-mercaptoetanol, EDTA y cloruro de magnesio. Transfiera cada reacción a un pozo en una placa plana de 96 pozos adecuada para la lectura de fluorescencia, asegurándose de preparar al menos cuatro reacciones, incluyendo un triplicado y un control negativo sin IGCP.
Coloque la placa en un lector de placas precalentado a 37 grados Centígrados. Mida la fluorescencia NBD cada minuto durante cinco minutos. A continuación, agregue gtP de cinco milímetros para inducir la fusión.
Mida la fluorescencia NBD cada minuto durante una hora utilizando la misma excitación y emisión que antes. Después de esto, añadir cinco microlitros de 2.5%n-Dodecyl beta-D-maltosido a los pozos para disolver los proteoliposomas, y medir la fluorescencia máxima NBD cada minuto durante 15 minutos utilizando la misma excitación y emisión. En este estudio, drosophila atlastin recombinante se purifica y reconstituye en liposomas preformados.
La eficiencia de la reconstitución de la atlastina se determina mediante proteoliposomas reconstituidos flotantes en un gradiente discontinuo de iohexol. Las muestras de las capas de gradiente superior, medio e inferior se cosechan y analizan mediante la tinción SDS-PAGE y Coomassie. La cuantificación del gel por densitometría muestra una eficiencia muy alta de reconstitución con pérdidas insignificantes, con el 96% de la proteína total que se encuentra como proteoliposomas que flotaban en la capa superior.
Menos del 1% de la proteína no se puede reconstituirse y se encuentra en la capa media, y sólo el 3% no se ha reconstituido ni se agrega y se sedimenta en la capa inferior. La orientación de la atlastina después de la reconstitución se cuantifica mediante ensayos de escote de trombina. Las muestras se analizan con tinción SDS-PAGE y Coomassie y se cuantifican por densitometría.
La mayor parte de la proteína reconstituida se corta, con sólo el 7% protegido de la proteasa. La cinética y la extensión de la fusión proteoliposoma mediada por atlastina se analizan mediante ensayos de mezcla de lípidos. Se realiza una incubación de cinco minutos antes de inducir la fusión con GTP en el punto de tiempo cero.
Después de una hora, n-Dodecyl beta-D-maltoside fue añadido para solubilizar los proteoliposomas y obtener la máxima liberación de transferencia de resonancia fluorescente. El máximo de fusión en la carrera se considera que es 11% de la fluorescencia máxima. Los lípidos se disuelven en cloroformo.
Al preparar las mezclas de lípidos, asegúrese de hacer esto rápidamente, en una capucha química y en hielo para evitar cualquier evaporación. Es posible analizar los proteoliposomas de atlastina por microscopía para visualizar los efectos de un ancla de membrana en la forma y el tamaño del liposoma. Este método se ha ampliado para estudiar otras proteínas ancladas a la membrana y cómo se comportan en una bicacapa de lípidos modelo.
Este protocolo utiliza lípidos valorados para cuantificar las mezclas de lípidos. Asegúrese de tomar las precauciones necesarias al trabajar con materiales radiactivos.
