洗涤剂辅助重组重组果蝇阿拉他素到脂质混合测定脂质体

此处详述的重组和融合协议是研究模样脂质双层和融合蛋白混合脂质混合膜结合蛋白的一种有效方法。在这里，我们描述了一个洗涤剂辅助重组重组的果蝇图马汀，ER融合蛋白，成预制磷脂酰胆碱脂质体。然后，通过基于F FRET的脂质混合测定来测量亚拉他汀蛋白体融合。

洗涤剂辅助重组的主要优势之一是洗涤剂中的蛋白质不会暴露在干燥或溶剂中。我们还在这里表明，地图集的重组方向是非常有效的。基于F FRET的脂质混合测定的另一个优点是，脂质体不需要加载任何染料，也不需要任何额外的透析步骤。

为了开始这一程序，请准备氯仿中的脂质混合物，如文本协议中所述。每毫升的 DPPC 添加一个微库到脂质混合物中，确保至少保留 8 微升的这种库存。将所需量的脂质混合物转移到火石玻璃管中。

然后在温和的氮气流下干燥脂质混合物约10分钟，直到不再可见氯仿。通过吸尘 30 分钟，在干燥器中进一步干燥产生的脂质膜。在此之后，加入足够的 A100 与 10%甘油，2 毫摩尔 2-二甲醇，和一毫摩尔 EDTA 到脂质膜，使浓度回到 10 毫摩尔。

在室温下轻轻涡旋15分钟，重新暂停脂质膜。在液氮中冷冻水合脂。要解冻脂质体，让溶液在室温下坐30秒，然后将它们转回水中，以更快地解冻。

重复此冻结解冻循环共 10 次。在此之后，使用迷你挤出机通过聚碳酸酯过滤器传递脂质，孔径为 100 纳米，19 倍。要确定脂质体的总脂质浓度，在三毫升闪烁鸡尾酒中加入四微升脂量和裂糖。

测量股票和脂质体每分钟的平均计数，并计算脂质体浓度，如文本协议中所述。将脂质体储存在摄氏四度，长达一周。首先，在0.5毫升管中混合适当数量的缓冲液、额外的洗涤剂和蛋白质，如文本协议中所述。

快速添加脂质体，并立即涡旋五秒钟，使混合物均匀。在摄氏四度下孵育一小时。在孵育过程中，称出0.2克聚苯乙烯吸附珠，并转移到微离心管。

在管中加入一毫升甲醇，混合一分钟，使珠子脱气。然后，用21规格或更高的针头吸气甲醇。要开始清洗珠子，请给珠子加水。

让珠子与水混合五分钟，然后吸水。重复此水洗过程四次。在此之后，加入水，将聚苯乙烯吸附珠浆带到一毫升的体积，最终浓度为每毫升0.2克。

计算吸附每个样品中所有洗涤剂所需的聚苯乙烯吸附珠的数量，如文本协议中所述。切一个移液器尖端来收集珠浆。将计算的珠浆量转移到0.5毫升管中，吸水。

将样品加入含有珠子的管子，在摄氏四度下孵育一小时。将样品转移到含有新珠子的新鲜管子中，确保将旧珠子留在后面。使用相同条件再次孵育。

重复转移和孵育珠子两次的过程。之后，将样品转移到含有新鲜珠子的新管子中，并在摄氏四度下过夜孵育。第二天，从珠子上取出样品，在16，000倍g和4摄氏度的离心机中10分钟，对不溶性蛋白质集料进行颗粒。

恢复上清液，并确定最终脂质浓度通过液体闪烁计数，如文本协议中概述。首先，将供体和接受方蛋白糖体在 A100 中各浓度为 0.15 毫摩尔，其中含有甘油、β-甲基苯丙酸、EDTA 和氯化镁。将每个反应转移到适合荧光读数的扁平 96 井板中的井中，确保至少准备四种反应，包括三酯和无 GTP 负对。

在 37 摄氏度下将板放入预热板读卡器中。每分钟测量五分钟 NBD 荧光。然后，加入五毫摩尔GTP诱导聚变。

使用与以前相同的激发和排放，每分钟测量一小时 NBD 荧光。在此之后，在井中加入5个2.5%n-Dodecyl beta-D-麦芽糖的微升，溶解蛋白糖体，并使用相同的激发和排放，每分钟测量最大NBD荧光量15分钟。在这项研究中，重组的果蝇图马汀被净化并重组成预制的脂质体。

地图集重建的效率由在 iohexol 不连续梯度中浮动重组的蛋白体决定。顶部、中间和底部梯度层的样本由 SDS-PAGE 和库马西染色采集和分析。通过密度测定对凝胶进行定量测量，显示重组效率非常高，损失可以忽略不计，96%的总蛋白质被发现为浮附到顶层的蛋白体。

不到1%的蛋白质未形成，发现在中间层，只有3%是未构成或聚合和沉积到底层。重组后图图丁的方向通过血栓蛋白裂解测定进行量化。用SDS-PAGE和库马西染色分析样品，通过密度测定进行量化。

大多数重组的蛋白质是裂开的，只有7%被保护免受蛋白酶的。通过脂质混合测定，分析了图马汀中位蛋白体融合的动力学和范围。在零时间点诱导与GTP融合之前，进行五分钟的孵育。

一小时后，n-Dodecyl beta-D-麦芽糖被添加，以溶解蛋白糖体，并得到最大的荧光共振转移释放。在运行中融合最大值被视为最大荧光的 11%。脂质溶解在氯仿中。

在准备脂质混合物时，请确保快速在化学罩上和冰上进行，以避免任何蒸发。通过显微镜分析图铂蛋白体，可以可视化膜锚对脂质体形状和尺寸的影响。这种方法已扩展至研究其他膜锚化蛋白，以及模型脂质双层层的行为方式。

该协议使用滴定脂质来量化脂质混合物。处理放射性物质时，请务必采取必要的预防措施。