여기에 자세히 설명된 재구성 및 융합 프로토콜은 모형 지질 이중층및 융합 단백질에 의한 지질 혼합에서 막 결합 단백질을 연구하는 능률적인 방법입니다. 여기에서 우리는 사전 형성된 인산염 리포좀으로, ER 융합 단백질인 재조합 Drosophila atlastin의 세제 보조 재구성을 설명합니다. 아틀라스틴 프로테올리포좀의 융합은 FRET 계 지질 혼합 분석으로 측정됩니다.
세제 보조 재구성의 주요 장점 중 하나는 세제의 단백질이 건조 또는 용매에 노출되지 않는다는 것입니다. 우리는 또한 여기에 아타스틴의 재구성 방향이 매우 효율적이라는 것을 보여줍니다. FRET 기반 지질 혼합 분석의 또 다른 장점은 리포솜이 염료를 적재할 필요가 없으며 추가 투석 단계가 필요하지 않다는 것입니다.
이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 엽록소형태로 지질 혼합 주식을 준비합니다. DPPC의 밀리리터 당 1개의 마이크로큐리를 지질 혼합물에 추가하여 최소 8개의 마이크로리터를 보관하십시오. 원하는 양의 지질 믹스를 부싯돌 유리 튜브로 옮킨다.
그런 다음 더 이상 클로로폼이 보이지 않게 될 때까지 약 10 분 동안 질소 가스의 부드러운 스트림 에서 지질 혼합물을 건조시십시오. 30분 동안 진공 청소기로 생성된 지질 필름을 건조기에서 더 건조시로 건조시로 건조시팅합니다. 그 후, 10%의 글리세롤, 2밀리머 2-메르카토에탄올, 1밀리머 EDTA를 충분한 A100을 지질 필름에 추가하여 농도를 10 밀리머로 되돌려 준다.
실온에서 15분 동안 가볍게 소용돌이치며 지질 필름을 재개봉합니다. 액체 질소에 수화 지질을 동결. 리포솜을 해동하려면 용액이 실온에 30초 동안 앉아서 다시 물로 옮겨 서 더 빠르게 해동합니다.
이 동결 해동 주기를 총 10회 반복합니다. 그 후, 미니 압출기를 사용하여 폴리카보네이트 필터를 통해 지질을 통과하고 100 나노미터의 모공 크기, 19 배. 지질의 총 지질 농도를 확인하려면 지질 육수와 리소좀 4개의 마이크로리터를 3밀리리터의 신경식 칵테일에 추가합니다.
스톡 및 리포솜의 분당 평균 수를 측정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 리포솜 농도를 계산합니다. 리포솜을 섭씨 4도까지 최대 1주일 동안 보관하십시오. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 양의 완충제, 여분의 세제 및 단백질을 0.5 밀리리터 튜브에 혼합합니다.
리포솜을 빠르게 추가하고 혼합물을 균질화하기 위해 5 초 동안 즉시 소용돌이합니다. 1 시간 동안 섭씨 4도에서 영양가에 반응을 배양. 이 잠복 하는 동안, 무게 0.2 폴리스티렌 흡착 구슬의 그램 과 마이크로 centrifuge 튜브에 전송.
튜브에 메탄올 1 밀리리터를 넣고 1분간 섞어 구슬을 탈유합니다. 그런 다음 메탄올을 21 게이지 이상의 바늘로 흡인시합니다. 구슬세척을 시작하려면 물을 넣습니다.
구슬이 물과 5분간 섞은 다음 물을 흡입합니다. 이 물 세척 과정을 4 번 반복하십시오. 그 후, 물을 추가하여 폴리스티렌 흡착 구슬 슬러리를 1 밀리리터의 부피에 넣고 밀리리터당 0.2 그램의 최종 농도를 제공합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플의 모든 세제를 흡착하는 데 필요한 폴리스티렌 흡착 구슬의 양을 계산합니다. 파이펫 팁을 잘라 비드 슬러리를 수집합니다. 계산된 양의 비드 슬러리를 0.5밀리리터 튜브로 옮기고 물을 흡입합니다.
비드가 들어 있는 튜브에 샘플을 추가하고 1시간 동안 섭씨 4도의 누테이너에 인큐베이션합니다. 샘플을 새로운 구슬이 들어 있는 신선한 튜브로 옮기고 오래된 구슬을 남겨두십시오. 동일한 조건을 사용하여 다시 인큐베이션합니다.
구슬을 두 번 옮기고 인큐베이팅하는 이 과정을 반복합니다. 그 후, 샘플을 신선한 구슬이 들어 있는 새로운 튜브로 옮기고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 누디닝하여 배양합니다. 다음 날, 비드 및 원심분리기에서 16, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 샘플을 제거하여 불용성 단백질 응집체를 펠렛합니다.
상체를 복구하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 액체 신경화 계수에 의해 최종 지질 농도를 결정한다. 시작하려면, 기증자와 수용자 프로테오폴좀을 글리세롤, 베타 메르카포에탄올, EDTA 및 염화 마그네슘을 함유하는 A100의 각각 0.15 밀리몰러 농도로 가져옵니다. 각 반응을 형광 판독에 적합한 평평한 96웰 플레이트에서 우물로 옮기고, 삼중 반응과 노-GTP 음성 제어를 포함하여 적어도 4개의 반응을 준비해야 합니다.
접시를 예열된 플레이트 판독기에 섭씨 37도에 넣습니다. 분당 5분 동안 NBD 형광을 측정합니다. 그런 다음 융합을 유도하기 위해 5 밀리마일러 GTP를 추가합니다.
이전과 동일한 흥분 및 방출을 사용하여 1시간 동안 1분마다 NBD 형광을 측정합니다. 그 후, 5개의 마이크로리터를 우물에 2.5%n-Dodecyl 베타-D-maltoside를 추가하여 프로테오올리포좀을 용해시키고, 동일한 흥분과 방출을 사용하여 15분 동안 분마다 최대 NBD 형광을 측정합니다. 이 연구에서, 재조합 드로소필라 아랫슬레이틴은 정제및 미리 형성된 리포솜으로 재구성된다.
아라스틴 재구성의 효율은 요오헥솔 불연속 그라데이션에서 재구성된 프로테오폴좀을 플로팅하여 결정한다. 상단, 중간 및 하단 그라데이션 층의 샘플은 SDS PAGE 및 Coomassie 염색에 의해 수확및 분석됩니다. 밀도에 의한 겔의 정량화는 무시할 수 있는 손실로 재구성의 매우 높은 효율을 나타내며, 총 단백질의 96%가 상부 층으로 떠있는 프로테올리포좀으로 발견된다.
단백질의 1% 미만은 재구성되지 않고 중간 층에서 발견되며, 3%만이 재구성되지 않거나 집계되고 바닥 층으로 퇴적됩니다. 재구성 후 아틀라스틴의 방향은 혈소분열 소세에 의해 정량화된다. 샘플은 SDS-PAGE 및 Coomassie 염색으로 분석되고 밀도에 의해 정량화됩니다.
재구성된 단백질의 대부분은 칼이 나고, 7%만이 프로테아제로부터 보호되고 있습니다. 운동학 및 아랫스틴 매개 프로테오폴모성 융합의 정도는 지질 혼합 분석에 의해 분석된다. 0시점에서 GTP와의 융합을 유도하기 전에 5분의 인큐베이션이 수행됩니다.
1시간 후, n-Dodecyl 베타-D-maltoside를 첨가하여 프로테오올리포좀을 용해시키고 최대 형광 공명 전달 방출을 얻습니다. 실행에서 의 융합 최대는 최대 형광의 11%로 보입니다. 지질은 클로로폼에 용해됩니다.
지질 믹스를 준비할 때, 화학 후드와 얼음에서 신속하게 이 작업을 수행하여 증발을 피하십시오. 미각검사로 아틀라스틴 프로테올리포좀을 분석하여 리포솜 모양과 크기에 막 앵커의 효과를 시각화할 수 있다. 이 방법은 다른 막 고정 단백질을 연구하고 모델 지질 이중층에서 어떻게 행동하는지 연구하기 위해 확장되었습니다.
이 프로토콜은 지질 혼합물을 정량화하기 위해 타이티드 지질을 사용합니다. 방사성 물질로 작업할 때 필요한 예방 조치를 취해야 합니다.
