O protocolo de reconstituição e fusão detalhado aqui é uma maneira eficiente de estudar proteínas ligadas à membrana em um modelo de bicamadas lipídicas e mistura lipídica por proteínas de fusão. Aqui descrevemos uma reconstituição assistida por detergente de atlastin drosophila recombinante, uma proteína de fusão ER, em lipossomos fosfatitas pré-formados. A fusão de proteoliposomes atlastin é então medida por um ensaio de mistura lipídica baseado em FRET.
Uma das principais vantagens da reconstituição assistida por detergente é que a proteína no detergente não está exposta à secagem ou solventes. Também mostramos aqui que a orientação de reconstituição da atlastin é muito eficiente. Outra vantagem do ensaio de mistura lipídica baseado em FRET é que os lipossomos não precisam ser carregados com qualquer corante, e não há necessidade de quaisquer passos de diálise extra.
Para iniciar este procedimento, prepare os estoques de mix de lipídios em clorofórmio, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione uma microcurie por mililitro de DPPC às misturas lipídicas, certificando-se de reservar pelo menos oito microliters deste estoque. Transfira a quantidade desejada das misturas lipídicas em tubos de vidro de pedra.
Em seguida, seque as misturas lipídicas sob um fluxo suave de gás nitrogênio por aproximadamente 10 minutos até que não se seja visível mais clorofórmio. Seque o filme lipídico resultante ainda mais em um desiccador aspirando por 30 minutos. Depois disso, adicione A100 suficiente com 10%de glicerol, 2-mercaptoetanol de dois milimólares e EDTA de um mililitro ao filme lipíduco para trazer a concentração de volta a 10 mililitros.
Resuspend o filme lipídudo vórtice levemente por 15 minutos em temperatura ambiente. Congele os lipídios hidratados em nitrogênio líquido. Para descongelar os lipossomos, deixe a solução ficar em temperatura ambiente por 30 segundos e depois transfira-os de volta para a água para um descongelamento mais rápido.
Repita este ciclo de congelamento um total de 10 vezes. Depois disso, use um mini-extrusor para passar os lipídios através de filtros de policarbonato, com um tamanho de poros de 100 nanômetros, 19 vezes. Para determinar a concentração lipídica total dos lipossomos, adicione quatro microliters de caldo lipídicos e lisesomos a três mililitros de coquetel de cintilação.
Meça a contagem média por minuto para estoque e lipossomos, e calcule a concentração lipossa, conforme descrito no protocolo de texto. Armazene os lipossomos a quatro graus Celsius por até uma semana. Primeiro, misture a quantidade apropriada de tampão, detergente extra e proteína em um tubo de 0,5 mililitro, conforme descrito no protocolo de texto.
Adicione rapidamente os lipossomos e imediatamente o vórtice por cinco segundos para homogeneizar a mistura. Incubar a reação em um nutador a quatro graus Celsius por uma hora. Durante esta incubação, pese 0,2 gramas de contas adsorentes de poliestireno e transfira-as para um tubo de microcentrífuga.
Adicione um mililitro de metanol ao tubo, e misture por um minuto para desgas as contas. Em seguida, aspire o metanol com uma agulha de calibre 21 ou superior. Para começar a lavar as contas, adicione água a elas.
Deixe as contas se misturarem com a água por cinco minutos e, em seguida, aspire a água. Repita este processo de lavagem de água quatro vezes. Depois disso, adicione água para levar o chorume de contas adsorbent de poliestireno a um volume de um mililitro, com uma concentração final de 0,2 gramas por mililitro.
Calcule a quantidade de contas adsorentes de poliestireno necessárias para adsorva todo o detergente em cada amostra, conforme descrito no protocolo de texto. Corte uma ponta de pipeta para coletar o chorume de contas. Transfira a quantidade calculada de chorume de contas para um tubo de 0,5 mililitro e aspire a água.
Adicione as amostras ao tubo contendo as contas e incuba em um nutador a quatro graus Celsius por uma hora. Transfira as amostras para um tubo fresco contendo novas contas, certificando-se de deixar as contas velhas para trás. Incubar novamente usando as mesmas condições.
Repita este processo de transferência e incubação das contas duas vezes. Depois disso, transfira a amostra para um novo tubo contendo contas frescas e incubar por nozes durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a amostra das contas e da centrífuga a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pellet os agregados de proteína insolúveis.
Recupere o sobrenante e determine a concentração lipídica final por contagem de cintilação líquida, conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, leve o doador e os proteolipóssos de aceitação a uma concentração de 0,15 milimola cada em A100 contendo glicerol, beta-mercaptoetanol, EDTA e cloreto de magnésio. Transfira cada reação para um poço em uma placa plana de 96 poços adequada para leitura de fluorescência, certificando-se de preparar pelo menos quatro reações, incluindo um triplicado e um controle negativo não-GTP.
Coloque a placa em um leitor de placas pré-aquecido a 37 graus Celsius. Meça a fluorescência de NBD a cada minuto durante cinco minutos. Em seguida, adicione GTP de cinco milimões para induzir a fusão.
Meça a fluorescência NBD a cada minuto durante uma hora usando a mesma excitação e emissão de antes. Depois disso, adicione cinco microlitadores de 2,5% n-Dodecyl beta-D-maltoside aos poços para dissolver os proteoliposomes, e medir a fluorescência máxima de NBD a cada minuto por 15 minutos usando a mesma excitação e emissão. Neste estudo, a atlastina de Drosophila recombinante é purificada e reconstituída em lipossomos pré-formados.
A eficiência da reconstituição da atlastina é determinada por proteoliposomes reototados flutuantes em um gradiente iohexol descontínuo. Amostras das camadas de gradiente superior, médio e inferior são colhidas e analisadas pela coloração SDS-PAGE e Coomassie. A quantificação do gel por densitometria mostra uma eficiência muito alta da reconstituição com perdas insignificantes, com 96% da proteína total sendo encontrada como proteoliposomes que flutuavam até a camada superior.
Menos de 1% da proteína é não constituída e encontrada na camada média, e apenas 3% é não constituída ou agregada e sedimentada à camada inferior. A orientação da atlastina após a reconstituição é quantificada por ensaios de decote trombina. As amostras são analisadas com coloração SDS-PAGE e Coomassie e quantificadas por densitometria.
A maior parte da proteína reconstituída é cortada, com apenas 7% sendo protegida da protease. A cinética e a extensão da fusão proteoliposome mediada por atlastina são analisadas por ensaios de mistura de lipídios. Uma incubação de cinco minutos é realizada antes de induzir a fusão com GTP no ponto de tempo zero.
Após uma hora, n-Dodecyl beta-D-maltoside foi adicionado para solubilizar os proteoliposomes e obter a liberação máxima de transferência de ressonância fluorescente. O máximo de fusão na corrida é visto como 11% de fluorescência máxima. Lipídios são dissolvidos em clorofórmio.
Ao preparar as misturas lipídicas, certifique-se de fazê-lo rapidamente, em uma capa química, e no gelo para evitar qualquer evaporação. É possível analisar os proteoliposomes atlastina por microscopia para visualizar os efeitos de uma âncora de membrana na forma e tamanho liposomos. Este método foi estendido para estudar outras proteínas ancoradas em membrana e como o comportamento em um modelo de bicamada lipídica.
Este protocolo usa lipídios titulados para quantificar misturas lipídicas. Certifique-se de tomar as precauções necessárias ao trabalhar com materiais radioativos.
