Este protocolo facilita los análisis cuantitativos a pequeña y gran escala del contenido de lípidos de almacenamiento celular en una variedad de especies de levaduras y lo hace de manera imparcial y estandarizada. La técnica permite el procesamiento rápido de imágenes microscópicas y proporciona salidas cuantitativas detalladas para comparar fácilmente muestras como varios mutantes y células cultivadas bajo diversas condiciones. Para comenzar, siga el protocolo de texto que lo acompaña para preparar las soluciones de tinción, los medios de cultivo y las células.
Asegúrese de que las células estén sanas y en la fase de crecimiento deseada antes de ejecutar el experimento. A continuación, prepare un cubreobjetos de microscopio para cada muestra a tomar imágenes. Extienda un microlitro de solución de recubrimiento deslizante en un cubreobjetos limpio utilizando el lado largo de una punta de pipeta colocada horizontalmente.
Deje que la solución de recubrimiento se seque por completo y, a continuación, almacene los cubreobjetos en un ambiente libre de polvo. A continuación, medir las densidades ópticas de los cultivos celulares, y para que los cultivos se analicen en la misma fase de crecimiento, tratar de alcanzar valores similares entre todos los cultivos probados para asegurar condiciones experimentales comparables. Luego, pipetear un mililitro del cultivo celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Sólo para las células S.cerevisiae, agregue cinco microlitros de la solución de recubrimiento deslizante al tubo también. Luego, voró brevemente todos los tubos de microcentrífuga, e incubarlos a 30 grados Celsius con temblor durante cinco minutos. A continuación, agregue un microlitro de la solución de tinción de lípidos a cada alícuota de cultivo, y vórtice brevemente.
A continuación, agregue 10 microlitros de la solución de visualización de límites de celda y vórqueles brevemente una segunda vez. Recoger las células centrifugando a 1.000 veces la gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente. Cuando termine de girar, retire 950 microlitros del sobrenadante y resusppend las celdas en el sobrenadante restante usando una pipeta.
A continuación, pipetear dos microlitros de la suspensión de células densas en un cubreobjeto recubierto de lectina. A continuación, coloque el cubreobjetos en una diapositiva de microscopio limpia para formar una monocapa celular y proceda a la microscopía lo más rápido posible para minimizar los artefactos en la toma de imágenes. La configuración del microscopio requiere exposiciones prolongadas a fuentes de luz fuertes que podrían causar daños en la muestra y sesgar los resultados.
Por lo tanto, configure las condiciones de imagen utilizando una diapositiva de muestra dedicada que no se utilizará más para la cuantificación de gotas de lípidos. Coloque la muestra dedicada en la etapa de una configuración del microscopio de contraste de fase o de interferencia diferencial y concéntrese en las células. En el software del microscopio, establezca los ajustes de la pila Z para que abarquen todo el volumen de la célula.
La distancia vertical total depende del tamaño de la celda y el número de sectores ópticos depende de la apertura numérica del objetivo. A continuación, establezca el foco para que se mueva en relación con el plano focal central. Para crear una imagen de gotas de lípidos, establezca experimentalmente la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal verde.
Tenga cuidado al tomar imágenes, ya que BODIPY es un fluorocromo muy brillante que puede ser rápidamente fotoblancada. Además, minimice el tiempo de exposición para evitar la sobresaturación. Capture primero el canal verde completo Z-stack antes de cambiar al canal azul para evitar desenfocar las gotas de lípidos móviles.
Para crear una imagen de los límites de las celdas, establezca experimentalmente la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal azul. Si es posible, configure y utilice un flujo de trabajo experimental automatizado en el software de control del microscopio para facilitar la toma de imágenes de varias muestras en condiciones estandarizadas. Es importante destacar que todas las imágenes deben adquirirse utilizando la misma configuración para permitir una comparación adecuada entre muestras.
Una vez optimizadas las condiciones de imagen, concéntrese en las celdas e irégenes en los canales verde y azul. Imagine varios campos de vista por muestra para obtener datos sólidos y representativos. Guarde las imágenes de la pila Z del canal azul y verde como archivos TIFF multicapa de 16 bits.
Asegúrese de incluir las palabras verde o azul en los nombres de archivo correspondientes. Abra imágenes microscópicas en ImageJ y elimine las pilas de imágenes que contengan un número considerable de celdas que se movieron durante la adquisición. Estos aparecen en diferentes posiciones en secciones Z individuales.
A continuación, elimine las pilas de imágenes que contengan partículas no celulares altamente fluorescentes en el canal azul. Esto a menudo es causado por la suciedad en la superficie de la imagen o las impurezas en el medio de cultivo y puede interferir con la detección de células en sus proximidades. Además, elimine las pilas de imágenes que contengan una gran proporción de celdas muertas.
Estas imágenes mostrarán celdas con mayor fluorescencia azul en comparación con las células vivas. Si bien la presencia de algunas células muertas en la muestra no suele ser un problema y estas células se descartan automáticamente durante el análisis, algunas células muertas o moribundas ocasionalmente pueden ser reconocidas como células vivas por el algoritmo de segmentación y, por lo tanto, sesgar los resultados notificados. Para comenzar el análisis en MATLAB, primero cree una carpeta principal y copie todos los scripts de MATLAB en esta ubicación.
A continuación, cree subcarpetas con los nombres de las distintas especies de levaduras y copie las imágenes TIFF respectivas en estas ubicaciones. Ahora, inicie MATLAB, abra el script MAIN. m, y ejecute el script.
En el menú, seleccione las especies de levadura que desea analizar e inicie el procesamiento de imágenes. Inspeccione y procese los archivos de salida según sea necesario mediante un editor de hojas de cálculo o un paquete estadístico. El flujo de trabajo produce archivos CSV separados por punto y coma y archivos TIFF segmentados con objetos de celda detectados y gotas de lípidos.
Aquí se muestran células S.pombe de tipo salvaje que se cultivaron en el medio complejo YES o en el medio EMM definido. En comparación con las células cultivadas en el medio YES, se detectaron menos gotas de lípidos y una mayor intensidad de tinción por unidad de volumen celular en el medio EMM. Además, las gotas lipídicas individuales formadas en el medio EMM eran más grandes y mostraban una mayor intensidad total de tinción.
Esto está de acuerdo con los hallazgos anteriores de un aumento del contenido de lípidos almacenados en células cultivadas en EMM. A continuación, estas imágenes muestran células S.japonicus de cultivos exponenciales y estacionarios tempranos cultivados en el medio YES. Las células que entraban en fase estacionaria mostraron una disminución notable del número de gotas lipídicas por unidad de volumen celular, mientras que la intensidad de fluorescencia de gotas lipídicas normalizada en volumen disminuyó ligeramente entre las dos condiciones.
Las primeras gotas de lípidos en fase estacionaria eran típicamente moderadamente más grandes en tamaño y tenían una intensidad de fluorescencia total moderadamente mayor en comparación con las gotas de las células que crecen exponencialmente. En las células S.cerevisiae cultivadas en fase exponencial versus estacionaria, las células estacionarias contenían algo menos de gotas lipídicas por unidad de volumen en comparación con las células de crecimiento exponencial. Sin embargo, su intensidad de fluorescencia de gotas normalizada por volumen casi se duplicó.
Este fuerte aumento en el contenido general de gotas lipídicas se debió a la intensidad de fluorescencia mucho mayor y al volumen de gotas lipídicas individuales en fase estacionaria. Después de este procedimiento, los datos de salida se pueden agregar en un paquete estadístico como R para crear gráficas de resultados resumidos y ejecutar pruebas estadísticas sobre cualquier diferencia observada en el contenido de gotas de lípidos. En principio, la canalización de procesamiento de imágenes se puede utilizar para el análisis del contenido de gotas de lípidos en otros microorganismos o para analizar otras estructuras subcelulares similares a puntos.
