Este método rastrea las estructuras de las células de levadura en tres dimensiones durante muchos minutos, lo que nos permite estudiar la dinámica de los orgánulos y compartimentos intracelulares. Las imágenes 4D aseguran que podamos sacar conclusiones confiables sobre la dinámica intracelular, particularmente para estructuras o marcadores que pueden ser transitorios. Demostrando el procedimiento estará Natalie Johnson, un postdoctorado de mi laboratorio.
Comience por cultivar un cultivo nocturno de la cepa de levadura de interés en cinco mililitros de sintético no fluorescente definido, o NSD, medio, en un matraz desconcertado de 15 mililitros con buena aireación, a 23 grados centígrados. De tres a cuatro horas antes del análisis, diluir el cultivo de levadura de fase logarítmica en medio NSD fresco, de modo que la densidad óptica final a 600 nanómetros, o OD600, será de 0,5 a 0,8 en el momento de la toma de imágenes. Al menos una hora antes de que el cultivo esté listo, centrifugar una alícuota de dos miligramos por mililitro de Concanavalina Una solución durante cinco minutos a toda velocidad, para peletizar cualquier partícula, y añadir 250 microlitros del sobrenadante en una placa de microscopía de fondo de vidrio limpio de 35 milímetros.
Después de 15 minutos, lave el plato de dos a tres veces con dos mililitros de agua destilada por lavado, añadiendo 250 microlitros del cultivo de levadura al plato recubierto de Concanavalin A después de que se seque. Espere 10 minutos para permitir que las células se adhieran, antes de lavar suavemente el plato dos o tres veces más con dos mililitros de medio NSD fresco. Luego cubra las células con dos mililitros de NSD fresco.
Para tomar imágenes de las células de levadura, seleccione una lente de inmersión de aceite 63X con una apertura numérica de al menos 1,4 en un microscopio de luz confocal. Aquí, también se puede utilizar una lente objetivo 100X en lugar de una lente objetivo 63X. A continuación, coloque el plato en la lente objetivo, manchado con aceite de inmersión.
En el menú desplegable de la pestaña Modo de adquisición, seleccione xyzt. En la pestaña XY, formatee el tamaño del marco a 256 de ancho por 128 de altura. Utilice la velocidad máxima de escaneo, que suele estar en el orden de ocho kilohercios.
Active el escaneo bidireccional X si está disponible y ajuste el factor de zoom a nueve, lo que dará como resultado un tamaño de píxel de aproximadamente 80 nanómetros. Si se utiliza un objetivo 100X, ajuste el factor de zoom en consecuencia para mantener un tamaño de píxel de aproximadamente 80 nanómetros. A continuación, establezca la acumulación de línea en cuatro o seis.
Ajuste el agujero a 1.2 unidades Airy y encienda el láser de luz blanca, si está disponible. A continuación, establezca la longitud de onda de excitación y el porcentaje de potencia láser para cada canal de fluorescencia. Si está disponible, habilite el uso del modo de recuento de fotones en la pestaña de configuración anulando la selección del tiempo máximo de integración.
Para cada canal de fluorescencia, asigne un detector de alta sensibilidad, establezca el rango de longitud de onda de emisión y active el modo de recuento de fotones, si está disponible. Establezca la ventana de medición de tiempo en 0,6 a 10 nanosegundos para cada canal de fluorescencia, para evitar capturar la luz reflejada de la placa de vidrio. A continuación, active las imágenes de campo brillante y seleccione un detector de baja sensibilidad para la recopilación de datos.
Active el modo de imágenes en vivo y active la ganancia en el canal de campo brillante hasta que las celdas sean claramente visibles. Si está en modo de recuento de fotones, cambie el rango de valores grises de manual a automático para ver la señal fluorescente. Establezca la pila Z para que imagine todo el volumen de las celdas de levadura y especifique la direccionalidad de la imagen de manera que hacia abajo se mueva hacia el resbalón de la cubierta.
Establezca el intervalo del paso Z en 0,25 a 0,35 micrómetros para obtener aproximadamente 20 a 25 secciones ópticas por pila Z y encienda el flujo galvo si está disponible. Para una película típica, establezca el intervalo de tiempo entre las pilas Z en dos segundos y establezca la duración de la película en cinco a 10 minutos. A continuación, guarde la película como un archivo LIF.
Para la desconvolución de película, inicie un programa de software de desconvolución adecuado que utilice el algoritmo clásico de estimación de máxima verosimilitud y abra la serie de datos. Seleccione el asistente de desconvolución y el editor de parámetros para confirmar que los parámetros de imagen se detectan y se muestran correctamente. Cambie el valor del índice de refracción del medio de incrustación a 1,4 para aproximar el citoplasma de levadura.
A continuación, utilice el editor para estimar la posición del deslizamiento de la cubierta. Seleccione Establecer todo verificado y haga clic en Aceptar y seleccione Entrar asistente. Haga clic en la flecha siguiente para omitir la selección de la función de propagación de puntos y las etapas de preprocesamiento de recorte, y continúe con el asistente de desconvolución para cada canal de fluorescencia.
Seleccione la función de mapeo vertical logarítmico de cálculo e inspeccione el perfil de intensidad de fluorescencia de datos sin procesar. Establezca manual como modo para la estimación de fondo, introduzca un valor de fondo y haga clic en Aceptar. Deje el valor máximo de las iteraciones en 40 e introduzca una relación señal/ruido estimada.
A continuación, desactive la corrección de lejía y haga clic en Deconvolve. Seleccione Aceptar al siguiente canal en la ventana de resultados de desconvolución, si el ruido se elimina lo suficiente sin eliminar la fluorescencia genuina de las estructuras tenues. Una vez que todos los canales fluorescentes se hayan desconvolucionado satisfactoriamente, haga clic en Todo hecho y organice primero el canal rojo, seguido de los canales de campo verde, azul y brillante, para su posterior edición en ImageJ.
A continuación, guarde la secuencia de imágenes como un archivo TIF de ocho bits y seleccione un archivo por canal y el estiramiento de contraste como modo de conversión. Para la corrección de lejía, importe las secuencias de imágenes desconvolucionadas en ImageJ y haga clic en Imagen, Hyperstacks y Apilar en Hyperstack para convertir las imágenes en una hiperapila. Seleccione xyzct en el menú desplegable e introduzca el número de canales, sectores de pila Z y marcos de tiempo.
Para corregir los canales de fluorescencia para el blanqueo fotográfico, seleccione Imagen, Color, Canales divididos y para canales fluorescentes, seleccione Plugins, EMBLtools, Corrección de lejía y Ajuste exponencial. A continuación, seleccione Imagen, Color y Canales de fusión para fusionar el campo brillante y blanquear los canales de fluorescencia corregidos en una hiperapila, y guarde la hiperapila corregida desconvolucionada y blanqueadora para la posterior generación y edición de películas como un archivo TIF de ocho bits. Para convertir el conjunto de datos corregidos desconvolucionados y blanqueadores en un montaje a escala, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Make Montage Series y seleccione la hiperapilante de ocho bits correspondiente.
Haga clic en Abrir y Aceptar para aceptar que todos los sectores se utilizarán para crear el montaje y haga clic en Aceptar de nuevo para aceptar el valor de factor de escala sugerido. Guarde el montaje original como un archivo TIF de ocho bits y seleccione Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack y OK, para crear una hiperapila 4D a partir del montaje original que incluye todos los marcos de tiempo. Para generar la película proyectada promedio original, primero seleccione Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack y OK, para aceptar los parámetros predeterminados de ZProjection.
Guarde la película proyectada promedio como un archivo TIF de ocho bits e inspeccione la película para identificar estructuras individuales que se pueden realizar un seguimiento durante su período de etiquetado. Identificar una estructura que se puede rastrear de forma fiable durante la duración de la película y aislar esa estructura para su análisis son los pasos más críticos del procedimiento. A continuación, siga las instrucciones de la guía del usuario del plugin, para aislar las estructuras de interés mediante la edición del montaje.
Cree una hiperapila 4D a partir del montaje editado para el período, incluidas las estructuras de interés, y guarde la hiperpilar editada. Para cuantificar la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo para la estructura aislada en la hiperapila 4D editada, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Analizar película editada, introduzca el intervalo de tiempo entre pilas Z y haga clic en Aceptar. Para crear una película final de la estructura aislada, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Project Hyperstack, especifique los sectores de la pila Z que se deben incluir, seleccione Intensidad media como tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Para crear una hiperapilante 4D con los datos originales sobre los datos editados, seleccione plugins, IJ_Plugins, Combinar dos hiperpilas y Colocar primero encima del segundo. Para generar una película a partir de la hiperapila 4D con los datos originales sobre los datos editados, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Project Hyperstack, especifique los sectores de pila Z que se deben incluir, seleccione Intensidad media como tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Aquí, el primer fotograma de una proyección de pila Z de datos sin procesar se puede comparar con los mismos datos corregidos desconvolucionados y blanqueadores.
Estos marcos de la misma película desconvolucionada y corregida por lejía muestran dos cisternas que fueron analizadas, que primero etiquetan con la proteína de glicosilación de resistencia Vanadate verde 4 o marcador Vrg4, y más tarde con el marcador rojo de proteína de transporte de genes Secretory 7 o Sec7. Este montaje, creado a partir de una hiperapila desconvolucionada y corregida por lejía, muestra todas las secciones ópticas en un solo punto de tiempo antes y después de la edición, para permitir el aislamiento de la señal de una de las cisternas elegidas. En esta figura, varios fotogramas de la película final de las pilas Z proyectadas se muestran con las proyecciones originales en la parte superior de la figura y proyecciones editadas en la parte inferior.
La cuantificación de las señales fluorescentes verdes y rojas del Golgi cisternae elegido revela que el marcador Verde Vrg4 llega y persiste durante unos 80 segundos, después de lo cual, el marcador rojo Sec7 llega y persiste durante unos 60 segundos, con una breve superposición entre los dos marcadores. Al realizar este procedimiento, es importante identificar las estructuras que se pueden realizar un seguimiento inequívoco a lo largo de su vida útil. El mismo tipo de análisis se puede realizar después de hacer una mutación o algún otro tipo de perturbación específica.
Esta técnica ha abierto el camino al estudio del comportamiento dinámico de Golgi cisternae y endoplasmático retículo retículo sitios utilizando la levadura como sistema modelo.
