Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos, Rhipicephalus microplus, popularmente conocido como la garrapata de ganado tiene un enorme impacto económico negativo en el ganado en las áreas tropicales. Además, las crecientes preocupaciones sobre las condiciones ambientales degradadas y las preocupaciones de salud pública causadas por el uso inapropiado de acaricidas químicos y el aumento de la resistencia de las poblaciones de garrapatas a los parásitos tradicionales, están estimulando la investigación sobre métodos de control alternativos, como el uso de hongos entomopatógenos. Estos entomopatógenos infectan activamente los huéspedes artrópodos, a través de su cutícula y colonizan su cuerpo.
El artrópodo puede tener diferentes respuestas a la infección fúngica. El sistema inmunitario artrópodo se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral implica el proceso de hemaglutinación y la producción de moléculas antimicrobianas, mientras que los hemocitos median la respuesta inmune celular.
La mayoría de los estudios sobre la respuesta inmunitaria artrópoda se notifican utilizando insectos, mientras que las respuestas a las garrapatas permanecen menos exploradas. Además, la inoculación de patógenos y la recolección de hemolímpia de garrapatas son técnicas poco extendidas necesarias para comprender mejor la respuesta inmunitaria del artrópodo. En consecuencia, este video address techniques-used para filmar la inoculación, la colección de hemólimpas y el procesamiento.
Dado que la recolección de hemocitos de garrapatas enfrenta algunas limitaciones, como la interrupción de las células, la obtención de un valor bajo de hemolymph y la baja concentración de células recuperadas. Infectar directamente en la configuración y el análisis de las células. Después de la recolección de garrapatas, lave a las hembras engordadas.
Use agua del grifo y sumerjala en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% durante tres minutos en un recipiente de vaso de precipitados de vidrio de 500 mililitros. Para la higiene de la cutícula, divida las hembras en grupos homogéneos con 20 hembras cada una. Se realizaron tres réplicas de cada grupo.
Metarhizium robertsii blastosporas se utilizaron en el proceso de inoculación. Añadir un líquido de cinco microlitros metarhizium blastospores suspensión a la superficie de una película de parafina de plástico. Para acelerar el proceso de inoculación, se pueden añadir múltiples burbujas a la superficie de película de parafina de plástico, cada burbuja correspondiente a cinco microlitros.
Utilice una jeringa de insulina ultrafina de un milímetro y una aguja de 0,3 milímetros para colocar una suspensión e inocularla en la garrapata. Recuerde sacar todo el aire de la jeringa antes de usarla. Inocular 5 microlitros de suspensión de hongos en la garrapata hembra entre el escutum y el capitulo.
Un pequeño volumen de hemolymph puede estar presente en el encuadre después de la incisión de la aguja. Tenga cuidado de no inocular el aire. Inocular a las hembras con suspensión de hongos entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra utilizando una jeringa de insulina ultrafina de un mililitro acoplada a una aguja de 0,3 milímetros.
Cuando la inoculación de las blastosporas de metarhizium se realiza entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un pequeño volumen de hemolymph puede estar presente en el muslo después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no inocular el aire. Utilice la parte de goma de una infusión alada establecer un tubo capilar de 0,3 miliimetros y una punta de filtro para realizar la colección de hemolímpido.
Interrumpir la cutícula dorsal femenina con una aguja de 0,3 milímetros. Después de la interrupción, aplique una presión suave sobre la parte anterial del cuerpo de la garrapata. Observe una agrupación líquida casi transparente fuera del sitio de interrupción.
Recoger la hemolymph chupando el líquido a través de la punta del filtro acoplado a una parte de goma de un conjunto de infusión alado y un tubo capilar de 0,3 milímetros. No presione el cuerpo de la garrapata apenas durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el punto medio y contaminar la hemolímpido. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el líquido sin contaminación.
Inmoviliza la garrapata. Corta un trozo de una pierna delantera. Una o más piernas se pueden cortar, así como la misma pierna se puede cortar más de una vez.
Aplique una presión suave sobre la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observe que una burbuja líquida transparente aparece en el lado cortado y recójala con el tubo capilar. No presione el cuerpo de la garrapata apenas, durante su movilización porque esto puede interrumpir el punto medio y contaminar la hemolímpido.
Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el líquido sin contaminación. Después de la recolección de hemólimpas, depositarlo en 1,5 mililitros microtubo previamente lleno de 30 microlitros de cóctel proteasa y 82 microlitros tampón de solución salina. Mantenga los microtubos sobre hielo durante toda la colección de hemólimpos.
Las muestras de centrífuga y el pellet suave de los hemocitos se formarán después de la centrifugación de la hemolímplo. Para la cuantificación de la hemolímpida, cuantifique el volumen de hemolímpido obtenido contando el volumen total dentro del microtubo y descontando el volumen de cóctel proteasa y tampón salino. Retire con cuidado la hemolinfa libre de células y vuelva a suspender suavemente las células.
Cuantifique los hemocitos colocando 10 microlitros de hemocitos re-suspendidos en la cámara Neubauer. Para la re-suspensión de las células se utilizó un medio de cultivo. Cortar la pierna delantera de la garrapata, aplicar una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata, observar una burbuja líquida transparente aparecen en el sitio de corte.
Aplique las gotas de hemólimpa directamente en las diapositivas limpias del microscopio. Después de eso, utilice los métodos apropiados para manchar las células. La inoculación entre el muslo de la pierna y la garrapata del cuerpo femenino también puede dañar los órganos internos de la garrapata, como la parte media y los túbulos malpighianos.
Cuando la garrapata en la parte media de la torcha es interrumpida por la aguja en la colección de hemólimpa dorsal, el líquido obtenido es rojo, no transparente. Esto indica una colección de hemolymph incorrecta. En este caso, la hemolímpido se desechará a medida que esté contaminada.
La contaminación por hemolímpla también se puede observar cuando la garrapata está infectada naturalmente con altas cargas de patógenos, o en los pasos finales después del proceso de muerte causado por patógenos inoculados. El volumen de hemolymph obtenido después de la colección dorsal es mayor que el volumen obtenido en la colección a través de la pierna. A pesar de la facilidad de contaminación es mayor en el primer método de recolección.
La concentración de hemocitos también fue significativamente mayor en la colección dorsal. Cuando se realiza la correcta colección de hemocitos se puede obtener un buen frotis y es posible distinguir diferentes hemocitos después de la tinción. Este video proporcionó información sobre los métodos para realizar la inoculación del patógeno, específicamente los hongos entomopatógenos, en las garrapatas y recoger su hemolímpia.
Las técnicas aquí presentadas requieren recursos tecnológicos muy bajos en nuestros pasos clásicos para los estudios sobre la fisiología de las garrapatas, la patología de las garrapatas y la respuesta inmunitaria de la garrapata. La correcta recolección de las células artrópodas y la hemolímpia libre de células es crucial para ofrecer información confiable para estudios posteriores. Por esta razón, también es importante ser consciente de los errores más comunes observados en la ejecución de estas técnicas.
Además, las propuestas de este estudio determinarán el lugar más apropiado para la recolección de hemólimpas mediante la deformación o corte de las piernas, teniendo en cuenta la diferencia en el volumen obtenido y la probabilidad de contaminación.
