Borrelia es un género de bacterias espiroquetas que abarca tres tipos principales. El grupo de borreliosis de Lyme, el grupo de fiebre recurrente y el grupo menos caracterizado que se encuentra en reptiles. Muchas especies de Borrelia son patógenas.
El cultivo de bacterias es el estándar de oro para la detección de infecciones. Esto es cierto tanto para la investigación como para el trabajo clínico. El cultivo de bacterias a partir de fluidos corporales y tejidos confirma que las bacterias son viables y se replican.
Este protocolo demuestra la metodología y las recetas necesarias para cultivar y preservar con éxito el grupo de espiroquetas de Lyme Boreliosis, Borrelia de fiebre recurrente y Borrelia miyamotoi. Se proporcionan métodos para el cultivo de especies y cepas previamente aisladas, así como nuevos aislados y aislados monoclonales de fuentes ambientales o de mamíferos. La demostrará el procedimiento a cargo de Marie-Line Faucillion, investigadora postdoctoral, e Ingela Nilsson, técnica del Laboratorio Bergstrom, Anne Berthold, investigadora asociada del Lloyd Lab, y Maryna Golovchenko, investigadora asociada del Laboratorio Rudenko.
Para empezar, obtenga los reactivos necesarios para preparar un litro de medio Barbara-Stoner-Kelly, o BSK-II. Comience disolviendo el BSA en un vaso de precipitados agitando el agua. Luego agregue todos los productos químicos secos y déjelos disolver antes de agregar CMRL.
Ajuste el pH del medio a 7.6. Si es necesario, use un hidróxido de sodio molar. A continuación, agregue suero de conejo al medio a una concentración de seis a 10%Si el crecimiento bacteriano no es fuerte, agregue otro a 2% de suero al medio.
Luego esterilice el medio usando un filtro de poro de 0.22 micras. Congelar el stock de mediano en alícuotas de 100 o 400 mililitros. Para las cepas de fiebre recurrente, agregue 100 mililitros de gelatina estéril al 7% a 400 mililitros de medio BSK-II.
Desinfecte la superficie y todos los materiales con etanol al 7% y transfiéralos inmediatamente al gabinete de seguridad biológica. Esterilice con UV todos los materiales no biológicos durante cinco minutos antes del inicio del trabajo. Para iniciar un cultivo, precaliente el medio en una incubadora.
Luego agregue un mililitro de cultivo de Borrelia descongelado de un stock de glicerol a cinco a 15 mililitros de medio BSK precalentado. Llene los tubos casi por completo para formar una atmósfera micro o anaeróbica antes de cerrarlos. Cultive especies de fiebre recidivante a 37 grados centígrados y especies de Borrelia burgdorferi sensu lato a 33 a 34 grados centígrados.
Monitoree el crecimiento del cultivo de Borrelia usando contraste de fase o microscopía de campo oscuro con un aumento de 200 a 400 veces. Para asegurar la distribución uniforme de las células, mezcle el cultivo con una pipeta serológica o use una pipeta de transferencia de tres mililitros mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo. Luego cargue a una alícuota de cultivo de 10 microlitros a cada lado de un hemocitómetro para contar.
A continuación, diluya el cultivo de Borrelia de fase exponencial en una proporción de uno a dos o uno a cuatro con un medio en un tubo de 1,7 mililitros. Al determinar el recuento de células, considere el factor de dilución adecuadamente. Después de su uso, rocíe las superficies y el hemocitómetro con lejía diluida al 10% y/o etanol al 70%.
Para la extracción de ADN o el aislamiento de células de Borrelia, centrifugar el cultivo en fase exponencial durante 10 minutos a 4.000 G y desechar el sobrenadante en un residuo de riesgo biológico adecuado. Procesar las bacterias peletizadas con un kit comercial de extracción de ADN o resuspenderlo en un medio apropiado para el experimento previsto. Al final de cada experimento, esterilice todos los equipos con etanol y radiación UV.
Recoja los residuos líquidos, incluido el exceso de cultivo, en una botella de desecho y agregue un 10% de lejía. Coloque la botella a 80 grados centígrados antes de desecharla. Para el almacenamiento a largo plazo de cultivos de Borrelia, tome el volumen deseado de un cultivo de fase exponencial de 10 millones a 100 millones de células por mililitro, agregue glicerol estéril al 10% y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Transfiera alícuotas de 1,5 mililitros de la mezcla a viales criogénicos con tapón de rosca de dos mililitros. Almacene los viales de stock a 80 grados centígrados. Mantenga un stock con al menos 10 tubos de cada cepa en el congelador, Para cultivar Borrelia de garrapatas duras, recolecte hembras adultas, machos y garrapatas ninfales.
Esterilice las garrapatas en la superficie sumergiéndolas en etanol al 70% durante dos minutos y séquelas al aire en un gabinete de bioseguridad. A continuación, disecciona las garrapatas individualmente en varias piezas con un bisturí estéril. Luego coloque las piezas en un tubo de dos mililitros que contenga 1.5 mililitros del medio suplementado con antibióticos.
Incubar los cultivos a 34 grados centígrados y verificar si hay espiroquetas mediante microscopía de campo oscuro o contraste de fase dos veces por semana durante las primeras dos semanas y semanalmente después durante seis semanas. Para cultivar Borrelia a partir de muestras de sangre, retire suavemente el plasma del tubo e inocule un mililitro de plasma en cinco mililitros de medio precalentado, Kelly-Pettenkofer modificado o MKP completo. Para el cultivo de Borrelia a partir de una biopsia de piel, esterilice la superficie de la biopsia de piel con 70% de etanol y peróxido de hidrógeno.
Luego coloque la muestra de biopsia en solución salina fisiológica. Corta la muestra en dos a seis trozos más pequeños usando una cuchilla de afeitar estéril en una placa de Petri de vidrio mientras estás sumergido en la solución salina fisiológica. Transfiera la muestra cortada en cubitos y un mililitro de solución salina en la que se almacenó la biopsia de piel en cinco mililitros de medio precalentado complementado con antibióticos, e incube a 33 grados centígrados.
Para hacer placas, caliente 300 mililitros de medio 1.5x BSK o MKP Complete sin gelatina. También caliente 200 mililitros de 1,7% agarosa a 55 grados centígrados. Mezcle los líquidos y pipete 15 mililitros cada uno sobre 16 placas de Petri profundas para hacer la capa inferior de agar.
Mantener el resto del medio en un baño de agua. Cuantificar la densidad de cultivo de Borrelia y diluir a la densidad deseada en un medio líquido. Después de que las placas inferiores se hayan solidificado, agregue 10 mililitros de la mezcla de agar restante como agar superior a un tubo de 15 mililitros que contenga la cantidad adecuada de espiroquetas.
Vierta la suspensión en la placa de agar inferior en la placa de Petri etiquetada. Después de que las placas se solidifiquen, ciérrelas y colóquelas boca abajo a 34 a 35 grados centígrados en dióxido de carbono al 2,5%. Cuando se preparó correctamente, el medio BSK apareció rojo-naranja y claro.
A modo de comparación, el medio no inoculado MKP también se muestra aquí. El crecimiento excesivo de bacterias competidoras genera turbidez y materiales agrupados en el medio. El crecimiento bacteriano fue monitoreado por inspección visual por contraste de fase o microscopía de campo oscuro.
En la fase exponencial, las células de Borrelia son típicamente delgadas, torcidas y modales hasta cierto punto. A medida que los cultivos entran en la fase estacionaria, los cuerpos redondos son cada vez más evidentes. Las células de Borrelia son fastidiosas y cada especie y cepa e incluso aislada difiere tanto genéticamente como a través de la adaptación al huésped del que han sido aisladas.
Al hacer medios, los ingredientes apropiados hacen una enorme diferencia en el vigor de la cultura Borrelia o incluso en la viabilidad de la cultura. Las espiroquetas de Borrelia son un desafío para la cultura, pero la cultura es posible. El cultivo en el laboratorio es el trampolín para la investigación sobre la biología de estas bacterias.
La cultura proporciona el material para comprender el genoma, el proteoma, la evolución y las interacciones patógenas del huésped de la especie Borrelia. El cultivo de borrelia puede tomar varias semanas antes de que las espiroquetas sean lo suficientemente abundantes para su detección. Esto limita las aplicaciones de diagnóstico.
Pero el cultivo puede mostrar si las especies de Borrelia están presentes, son viables y se replican, y puede ayudar a acceder a los tratamientos.
