Keneler hematophagous ektoparazitler vardır, Rhipicephalus microplus, halk sığır kene olarak bilinen tropikal alanlarda hayvancılık üzerinde büyük olumsuz ekonomik etkisi vardır. Buna ek olarak, kimyasal acarisitlerin uygunsuz kullanımı ve kene popülasyonlarının geleneksel parazitlere karşı artan direncinden kaynaklanan bozulmuş çevre koşulları ve halk sağlığı endişeleri hakkındaki endişeler, entomopatojenik mantar kullanımı gibi alternatif kontrol yöntemleri üzerine araştırma yığılmasıdır. Bu entomopatojenler eklembacaklı konaklarını etkenolarak enfekte eder ve vücutlarını kolonize ederler.
Eklembacaklımantar enfeksiyonuna farklı tepkiler verebilir. Eklembacaklı bağışıklık sistemi mizahi ve hücresel tepkiler e ayrılır. Humoral yanıt hemagglutinasyon süreci ve antimikrobiyal moleküllerin üretimini içerir, hemositler hücresel immün yanıt aracılık ederken.
Eklembacaklı immün yanıt üzerine yapılan çalışmaların çoğu böcekler kullanılarak rapor edilirken kene yanıtları daha az araştırılmış durumdadır. Ayrıca, patojen aşılama ve kene hemolenf toplama eklembacaklı bağışıklık yanıtını daha iyi anlamak için gerekli kötü yaygın tekniklerdir. Buna göre, bu video adresi teknikleri \aşılama, hemolenf toplama ve işleme filme kullanılır.
Kene hemositleri hasat, hücre bozulması, düşük hemolenf değeri elde edilmesi ve kurtarılan hücrelerin düşük konsantrasyonu gibi bazı sınırlamalarla karşı karşıya dır. Doğrudan hücre yapılandırma ve analiz enfekte. Kene toplama sonra, tıkanmış dişiler yıkayın.
Musluk suyu kullanın ve 500 mililitre cam kabı alıcı üç dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit çözeltisi onları batırın. Kütikül hijyeni için dişileri homojen gruplara, her biri 20 dişiile bölün. Her gruptan üç kopya yapıldı.
Aşılama sürecinde metarhizium robertsii blastosporlar kullanıldı. Plastik bir parafin filminin yüzeyine beş mikrolitre metarhizium blastospores süspansiyon bir sıvı ekleyin. Aşılama işlemini hızlandırmak için, her kabarcık beş mikrolitreye karşılık gelen plastik parafin film yüzeyine birden fazla kabarcık eklenebilir.
Bir milimetreultra ince insülin şırınga ve 0.3 milimetrelik bir iğne kullanarak süspansiyon uyup kenenin içine aşılamak için kullanın. Kullanmadan önce şırınganın tüm havasını almayı unutmayın. Scutum ve capitulum arasında kene kadın içine mantar süspansiyon 5 mikrolitre aşılamak.
İğne kesiğinden sonra çerçevelemede küçük bir hacim de hemolenf olabilir. Hava aşılamamaya dikkat edin. 0.3 milimetrelik bir iğne ile bir mililitre ultra ince insülin şırınga kullanarak bacak uyluk ve kadın vücudu arasında mantar süspansiyon ile aşılamak.
Metarhizium blastospores aşılama bacak uyluk ve kene kadın vücudu arasında yapıldığında, hemolenf küçük bir hacim iğne yerleştirildikten sonra uyluk üzerinde mevcut olabilir. Hava aşılamamaya dikkat edin. Kanatlı bir infüzyon kauçuk parçası kullanın 0.3 miliimeters kılcal tüp ve hemolenf toplama gerçekleştirmek için bir filtre ucu ayarlayın.
0.3 milimetrelik bir iğne kullanarak dişi dorsal mitikülbozun. Bozulmadan sonra kene gövdesinin anterial kısmına hafif basınç uygulayın. Neredeyse saydam bir sıvının bozulma alanından çıktığını gözlemleyin.
Kanatlı infüzyon seti ve 0.3 milimetre kılcal tüp bir lastik parçası ile birleştiğinde filtre ucu ile sıvı emerek hemolenf toplamak. Bu midgut bozabilir ve hemolenf kontamine olabilir, çünkü immobilizasyon sırasında kene vücuduna zor basmayın. Hafif basınç kontaminasyon olmadan sıvı dışarı atabilirsiniz kadar bekleyin.
Keneyi etkisiz hale getir. Ön bacaktan bir parça kes. Bir veya daha fazla bacak kesilebilir yanı sıra aynı bacak birden fazla kez kesilebilir.
Kenenin arka vücut kısmına hafif basınç uygulayın. Şeffaf bir sıvı kabarcık kesilmiş tarafında göstermek gözlemlemek ve kılcal tüp ile toplamak. Bu midgut bozabilir ve hemolenf kontamine olabilir, çünkü seferberlik sırasında kene vücuduna zor basmayın.
Hafif basınç kontaminasyon olmadan sıvı dışarı atabilirsiniz kadar bekleyin. Hemolenf toplama sonra, daha önce 30 mikrolitre proteaz kokteyl ve 82 mikrolitre tuzlu tampon ile doldurulmuş 1.5 mililitre mikrotüp yatırın. Mikrotüpleri hemolenf koleksiyonu boyunca buz üzerinde tutun.
Hemolenf santrifüjünden sonra santrifüj örnekleri ve hemositlerin yumuşak peleti oluşacaktır. Hemolenf niceliği için, mikrotüp içindeki toplam hacmi sayarak ve proteaz kokteyl ve tuzlu tampon hacmini azaltarak elde edilen hemolenf hacmini ölçün. Dikkatle supernatant hücresiz hemolenf kaldırmak ve yavaşça hücreleri yeniden askıya.
Neubauer odasına 10 mikrolitre yeniden asılı hemosit yerleştirerek hemositleri ölçün. Hücreler için yeniden askıya alma bir kültür ortamı kullanılmıştır. Kenenin ön bacağını kesin, kenenin arka vücut kısmına hafif basınç uygulayın, kesilen bölgede saydam bir sıvı kabarcığı gözlemleyin.
Hemolenf damlalarını doğrudan temiz mikroskop slaytlarına uygulayın. Bundan sonra hücreleri lekelemek için uygun yöntemler kullanın. Bacak uyluk ve kene kadın vücudu arasında aşılama da midgut ve malpighian tübülleri gibi kene iç organlara zarar verebilir.
Kene midgut dorsal hemolenf koleksiyonunda iğne tarafından bozulduğunda elde edilen sıvı kırmızı, şeffaf değil. Bu yanlış bir hemolenf toplama gösterir. Bu durumda, hemolenf kontamine olarak atılır.
Kene doğal patojenlerin yüksek yükler ilerbulandığında ya da aşılanmış patojenlerin neden olduğu ölüm sürecinden sonraki son adımlarda hemolenf kontaminasyonu da görülebilir. Dorsal toplama dan sonra elde edilen hemolenf hacmi, bacak yoluyla toplama da elde edilen hacimden daha yüksektir. Kontaminasyon kolaylığına rağmen ilk toplama yönteminde daha yüksektir.
Hemosit konsantrasyonu da dorsal koleksiyonda önemli ölçüde daha yüksekti. Doğru hemosit toplama yapıldığında iyi bir yayma elde edilebilir ve boyama sonra farklı hemositayırt etmek mümkündür. Bu video, patojenin, özellikle entomopatojenik mantarların keneler içine aşılama ve hemolenf toplamak için yöntemler hakkında bilgi sağladı.
Burada sunulan teknikler kene fizyolojisi, kene patolojisi ve kene bağışıklık yanıtı ile ilgili çalışmalar için klasik adımlarımızda çok düşük teknolojik kaynaklar gerektirir. Eklembacaklı hücrelerin doğru hasat, ve hücresiz hemolenf sonraki çalışmalar için güvenilir bilgi göze çok önemlidir. Bu nedenle, bu tekniklerin uygulanmasında gözlenen en yaygın hataların farkında olmak da önemlidir.
Ayrıca, bu çalışmanın önerileri, elde edilen hacim ve kontaminasyon olasılığı arasındaki fark göz önünde bulundurularak, bacakların deforme edilmesi veya kesilmesi yoluyla hemolenf toplama için daha uygun bir alan belirleyecektir.
