Клещи гематофагические эктопараситы, Rhipicephalus microplus, известный в народе как клещ крупного рогатого скота имеет огромное негативное экономическое воздействие на домашний скот в тропических районах. Кроме того, растущая озабоченность по поводу деградированных условий окружающей среды и проблем общественного здравоохранения, вызванных ненадлежащим использованием химических акарицидов и повышением устойчивости популяций клещей к традиционным паразитам, стимулирует исследования альтернативных методов контроля, таких как использование энтомопатогенных грибов. Эти ентомопатогены активно заражают членистоногих хозяев, через их кутикулу и колонизировать их тело.
Членистоногий может иметь различные ответы на грибковую инфекцию. Иммунная система членистоногих делится на гуморальные и клеточные реакции. Гуморальный ответ включает в себя процесс гемагглютинации и производство противомикробных молекул, в то время как гемоциты опоясывания клеточного иммунного ответа.
Большинство исследований на членистоногих иммунного ответа, как сообщается, с использованием насекомых в то время как клещ ответы остаются менее изучены. Кроме того, патогенная прививка и сбор гемолимф клещей являются плохо распространенными методами, необходимыми для лучшего понимания иммунного ответа членистоногих. Соответственно, этот видео адрес techniques'used для фильма прививки, гемолимфа сбора и обработки.
Так как тик гемоцитов сбора сталкиваются с некоторыми ограничениями, такими как нарушение клеток, низкое значение гемолимфа получения, и низкая концентрация восстановленных клеток. Непосредственное заражение конфигурацией и анализом клеток. После сбора клещей, мыть engorged женщин.
Используйте водопроводную воду и погрузите их в 0,5% гипохлоритный раствор натрия в течение трех минут в 500 миллилитров стакан получателя. Для гигиены кутикулы, разделить женщин в однородных группах с 20 самок каждая. Было выполнено по три тиража каждой группы.
Метаризий робертси бластоспоры были использованы в процессе прививки. Добавьте на поверхность пластиковой парафиновой пленки жидкость из пяти микролитров метаритиза бластоспоров. Чтобы ускорить процесс прививки, несколько пузырьков могут быть добавлены к пластиковой поверхности парафиновой пленки, каждый пузырь, соответствующий пяти микролитров.
Используйте одномиллиметровый сверхтонкий инсулиновый шприц и иглу диаметром 0,3 миллиметра, чтобы положить суспензию и привить ее клещу. Не забудьте взять весь воздух из шприца, прежде чем использовать его. Привить 5 микролитров суспензии гриба в клещевой самке между скутом и капитулом.
Небольшой объем гемолимфы может присутствовать на обрамлении после разреза иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух. Прививают самок с суспензией гриба между бедром ноги и женским телом с помощью одномиллилитрового сверхтонкого инсулинового шприца в сочетании с иглой диаметром 0,3 миллилитров.
Когда метаризий blastospores прививки выполняется между бедром ноги и тело клеща женщины, небольшой объем гемолимфа может присутствовать на бедре после вставки иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух. Используйте резиновую часть крылатого инфузии установить 0,3 милиметра капиллярной трубки и фильтр отзыв для выполнения коллекции гемолимф.
Нарушить женскую спинную кутикулу с помощью иглы 0,3 миллиметра. После нарушения нанесите мягкое давление на предродовую часть тела клеща. Наблюдайте за почти прозрачной жидкостью, которая выходит из места нарушения.
Соберите гемолимф, сосать жидкость через кончик фильтра в сочетании с резиновой частью крылатого набора настоя и 0,3 миллиметра капиллярной трубки. Не нажимайте тело клеща вряд ли во время его иммобилизации, потому что это может нарушить midgut и загрязнять гемолимфа. Подождите, пока нежное давление может изгнать жидкость без загрязнения.
Обездвижить клеща. Отрежьте кусок передней ноги. Одна или несколько ног могут быть сокращены, а также же ноги могут быть сокращены более одного раза.
Нанесите мягкое давление на заднюю часть тела клеща. Наблюдайте прозрачный жидкий пузырь, появляйся на разрезанной стороне и собирайте его с капиллярной трубкой. Не нажимайте тело клеща вряд ли, во время его мобилизации, потому что это может нарушить midgut и загрязнять гемолимфа.
Подождите, пока нежное давление может изгнать жидкость без загрязнения. После сбора гемолитфа, депозит его в 1,5 милилитров микротрубки ранее заполнены 30 микролитров протеазы коктейль и 82 микролитров солевого буфера. Храните микротрубки на льду по всей коллекции гемолимф.
Образцы центрифуг и мягкие гранулы гемоцитов будут образовывания после центрифугации гемолимпы. Для количественной оценки гемолимф количественно объем гемолимфа, полученный путем подсчета общего объема внутри микротрубки и дисконтирования объема протеазы коктейль и солевой буфер. Аккуратно удалите супернатантную гемолимфу без клеток и аккуратно приостановите клетки.
Количественная оценка гемоцитов путем размещения 10 микролитров повторно приостановленных гемоцитов в камере Нойбауэра. Для повторной приостановки ячеек использовалось культурное мультимедиа. Отрежьте переднюю ногу клеща, нанесите мягкое давление на заднюю часть тела клеща, наблюдайте прозрачный жидкий пузырь, появляемый на участке разреза.
Нанесите капли гемолимфа прямо на чистые слайды микроскопа. После этого используйте соответствующие методы, чтобы испачкать клетки. Прививка между бедром ноги и тик женского тела может также повредить клеща внутренних органов, таких как мидгут и мальпигских трубок.
Когда тик midgut нарушается иглы на спинной гемолимфа сбора жидкости, полученной красного цвета, а не прозрачным. Это указывает на неправильную коллекцию гемолимф. В этом случае гемолимфа должна быть отброшена, так как загрязнена.
Загрязнение гемолимфой также может наблюдаться, когда клещ естественным образом заражен высокими нагрузками патогенных микроорганизмов, или на заключительных этапах после процесса смерти, вызванного привитых патогенов. Объем гемолимфы, полученный после спинной коллекции, выше объема, полученного в коллекции через ногу. Несмотря на легкость загрязнения выше в первом методе сбора.
Концентрация гемоцитов была также значительно выше в спинной коллекции. При правильном сборе гемоцитов можно получить хороший мазок и отличить различные гемоциты после окрашивания. Это видео предоставило информацию о методах выполнения прививки патогена, в частности, ентомопатогенных грибов, в клещей и собирать их гемолимфа.
Представленные здесь методы требуют очень низких технологических ресурсов в наших классических шагах для исследований физиологии клещей, патологии клещей и иммунного ответа клеща. Правильная уборка членистоногих клеток и гемолимфа без клеток имеет решающее значение для получения надежной информации для последующих исследований. По этой причине также важно знать о наиболее распространенных ошибках, наблюдаемых при выполнении этих методов.
Кроме того, предложения этого исследования должны определить более подходящее место для сбора гемолимф путем деформации или резки ног, учитывая разницу в полученном объеме и вероятность загрязнения.
