Este protocolo es significativo porque el uso de tejido congelado simplifica la logística al evaluar múltiples tejidos, permite la transferencia de muestras a un laboratorio remoto para su análisis y permite aplazar la decisión de analizar un tejido durante meses. La principal ventaja de esta técnica es que el uso de tejido cúbico congelado no requiere personal entrenado en el ensayo del cometa en la necropsía, y minimiza la oportunidad de errores técnicos y daños mecánicos en el ADN introducidos durante la manipulación de la muestra. Esta técnica tiene aplicación en el desarrollo de fármacos preclínicos, la evaluación de la inocuidad de los productos químicos que entran en el medio ambiente y aditivos alimentarios.
Los tejidos congelados se pueden utilizar en el ensayo del cometa para evaluar el potencial genotóxico, la reparación del ADN, los efectos protectores contra el daño del ADN inducidos por la quimioterapia o la radiación, y para la biocontrola ambiental. Idealmente, los experimentos deben diseñarse para permitir el procesamiento de cada muestra de tejido hasta el paso de congelación antes de que los órganos cosechados del siguiente animal estén disponibles para su procesamiento. Los tejidos congelados pueden ser demandados en el ensayo del cometa para evaluar el potencial genotóxico, la reparación del ADN, los efectos protectores contra el daño del ADN inducido por la quimioterapia o la radiación, y para la biocontrola ambiental.
La entrenadora técnica Carole Bobbitt, y la gerente del laboratorio de toxicología de investigación Eileen Gilas estarán sirviendo como prosectores hoy. El investigador asociado Lincoln Martin, y el técnico de histología Amelie Ladesseur demostrarán el manejo de muestras. Para comenzar este procedimiento, extraiga cualquier tejido, órganos y desechos de conexión conectados de un órgano de interés.
Inmediatamente agita el órgano vigorosamente en un bote de peso de tamaño medio que contiene aproximadamente siete mililitros de solución de picado fría y recién preparada para eliminar la sangre residual y los desechos. Transfiera el órgano a otro bote de pesaje limpio que contenga suficiente solución de picado en frío para mantener el tejido sumergido y mantenerlo sobre hielo hasta su posterior procesamiento. Para el hígado, corte una sección longitudinal de cinco milímetros del lóbulo izquierdo y gire suavemente en unos siete mililitros de solución de picado en frío.
A continuación, coloque la tira de tejido en un recipiente limpio de tamaño medio que contenga aproximadamente siete mililitros de solución de picado en frío y mantenga en hielo hasta que esté listo para procesarse más. Retire una sección del hígado y colóquela en un cassette incrustado. Realice la fijación, el recorte y la incrustación de parafina de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio para una posible evaluación futura de la histopatología.
Para el duodeno, corte una porción de 10 milímetros del duodeno proximal al estómago. Inserte una aguja de calibre 21 a 25 en un extremo del duodeno y eléjela con un mililitro de solución de picado en frío para eliminar cualquier residero y bacteria. Voltee el duodeno, enjuájelo de nuevo con otro mililitro de solución de picado y deseche la aguja.
Cortar el duodeno abierto y enjuagar en unos siete mililitros de solución de picado. A continuación, enjuague el duodeno de nuevo y mantenerlo en solución de picado sobre hielo hasta que esté listo para procesarlo más. Corte y fije una porción del duodeno restante para una posible evaluación futura de histopatología como se describió anteriormente para el hígado.
Para el cerebro, puede ser útil dividir primero el cerebro en dos hemisferios, con un hemisferio guardado para una posible histopatología. Diseccionar las regiones cerebrales de interés, luego enjuáguelas suavemente y mantengalas sobre hielo en la solución de picado hasta que estén listas para procesarse más, como se describió anteriormente para el hígado y el duodeno. Para el estómago, retire y deseche el bosque.
Abra el estómago glandular y lávelo de los alimentos girándolo en un bote de pesaje de tamaño mediano que contenga alrededor de siete mililitros de tampón de picado en frío. Retire una tira de cinco milímetros de proximal glandular del estómago al duodeno para fijarla para una posible evaluación histopatología como se describió anteriormente. Coloque el estómago restante en un bote de pesaje de tamaño mediano que contenga aproximadamente siete mililitros de tampón de picado en frío e incubar en hielo durante 15 a 30 minutos.
Después de esto, transfiera el estómago a una pieza limpia de parafina y use una cuchilla de bisturí o un rascador de células de plástico para raspar suavemente el epitelio de la superficie al menos dos veces para eliminar los desechos. Recoger la mucosa gástrica con fórceps y utilizar una pipeta para enjuagar con un mililitro de tampón de picado en frío. Transfiera el tejido estomacal enjuagado a una superficie o plato limpio y agregue una solución de picado fría.
Usa la parte posterior de una cuchilla de bisturí o un rascador de células de plástico para raspar cuidadosamente el epitelio estomacal de cuatro a cinco veces para liberar las células. Luego, utilice una pipeta para recoger la solución de picado que contiene las células liberadas y transfiétela a un tubo de microcentrífuga sobre hielo. Para extraer muestras de tejido, corte una sección de hígado, cerebro o duodeno y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga etiquetado que contenga un mililitro de solución de picado en frío.
Utilice tijeras de picado para picar rápidamente la muestra hasta que finalmente se disperse, a la vez que se asegura de que la muestra permanezca fría. La muestra debe verse ligeramente turbia. Sin embargo, es común que algunas piezas permanezcan que se asientan en la parte inferior del tubo.
Para usar el tejido mientras está fresco, mantenga los tubos que contienen las muestras sobre hielo. Para congelar las muestras de tejido, fije la tapa del tubo inmediatamente después de la picadura o recolección y suelte el tubo en un matraz Dewar que contenga nitrógeno líquido. Al final de la recolección de tejido, use un regazo para recuperar los tubos de muestra y colóquelos en hielo seco para clasificarlos.
Transfiera los tubos a una caja de congelador sobre hielo seco y guárdelo en un congelador a menos 80 grados Centígrados. Para preparar cubos congelados de tejido, corte varios trozos pequeños de tejido y suéltelos individualmente directamente en un bote de pesaje de tamaño mediano u otro recipiente adecuado que contenga nitrógeno líquido durante unos segundos. Después de que las piezas se hayan congelado por completo, transfiera los cubos de tejido congelados individualmente a tubos de microcentrífuga etiquetados, o criotubos, sobre hielo seco.
Al final de la recolección de tejido, transfiera los tubos a una caja de congelador sobre hielo seco y guarde la caja en un congelador a menos 800 grados Centígrados. Cuando utilice tejido recién picado o raspado mantenido sobre hielo húmedo, prepare los portaobjetos de cometa dentro de una hora de la cosecha. Cuando utilice tejido picado o raspado congelado, coloque los tubos de tejido congelado en un baño de agua a temperatura ambiente hasta que las muestras se descongelen por completo mientras se asegura de que se mantengan frías.
Una vez que las muestras se descongelen, transfiera inmediatamente los tubos al hielo. Para el tejido en cubos, recupere los tubos que contienen los cubos del congelador y mantenga en hielo seco hasta la preparación del portaobjetos. Aliquot un mililitro de medio del comerciante o una solución de picado en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros etiquetado para cada muestra y mantener en hielo.
Trabajando rápidamente para evitar la descongelación, coloque un cubo de tejido en el extremo abierto de un dispositivo de picadura de tejido a temperatura ambiente. Inserte rápidamente un émbolo de jeringa emparejado en el dispositivo para empujar el tejido en el extremo de la malla, que luego debe colocarse en el tubo de microcentrífuga que contiene la solución de picado en frío. Sumerja el extremo de malla del dispositivo durante aproximadamente cinco a 10 segundos en la solución de picado en frío para permitir que el tejido se descongele por completo.
Presione completamente el émbolo hasta que se vean las células que extruyen a través de los poros de malla. A continuación, tire del émbolo hacia arriba aproximadamente 2,5 centímetros y presione hacia abajo de nuevo completamente. Repita varias veces, hasta que la solución de picado se vuelva turbia.
Para preparar los portaobjetos, mezcle suavemente una suspensión celular y transfiera 50 microlitros a un tubo que contenga 450 microlitros de 0,5% de baja agarosa de punto de fusión a 37 grados centígrados. Prepare y punte las diapositivas como se describe en el protocolo de texto. En el primer estudio, el hígado fue cosechado de dos cohortes de ratas macho de control de vehículos Sprague Dawley escalonadas por una semana.
Los portaobjetos se preparaban a partir de tejido recién picado, tejido picado congelado y tejido en cubos congelado. Dado que el límite superior recomendado por la OCDE para el porcentaje de ADN de cola en hígado de rata fresco es 6%, estos resultados demuestran que cualquiera de los métodos de congelación puede funcionar bien para evaluar el tejido. En general, el porcentaje de erizos fue paralelo al porcentaje de ADN de cola, aunque los tejidos congelados mostraron una mayor variabilidad.
En el segundo estudio, se administraron ratones hembra B6C3F1 en vehículo o el metanesulfonato etílico de mutagen. El porcentaje de resultados de ADN de cola indican que el tejido hepático congelado como cubos y posteriormente procesado utilizando el dispositivo de picadura de tejido produjo resultados muy similares a los obtenidos para el tejido recién picado. Se midió un aumento estadísticamente significativo del daño del ADN inducido por el SME en muestras de tejido procesadas por los tres métodos.
En el tercer estudio, se analizaron muestras hepáticas recogidas de ratones hembra B6C3F1 en un estudio de toxicidad química de 90 días. El daño del ADN en el tejido picado congelado fue alto en todos los grupos de dosis, con una variabilidad sustancial entre animales. El porcentaje de resultados del ADN de cola se correlacionó con el porcentaje de erizos, lo que indica que los erizos contribuyeron sustancialmente al alto nivel de daño en el ADN que se observó en estas muestras.
Por el contrario, tanto los erizos dañados por el ADN como los que estaban porcentualmente ser muy bajos en el tejido en cubos congelado que se había preparado en paralelo con las muestras de tejido picado. Por lo tanto, las células altamente dañadas manifestadas como erizos en las muestras de tejido picado claramente no fueron el resultado de un proceso biológico, pero probablemente fueron introducidas por una interrupción mecánica, y o el calentamiento de los tejidos durante el procedimiento de picadura antes de ser congelados. Por lo tanto, los datos de tejido picado se consideraron poco fiables.
En comparación, se obtuvieron datos de alta calidad del tejido en cubo congelado, incluso después de un almacenamiento prolongado. Es fundamental mantener los tejidos cosechados fríos y húmedos, y trabajar rápidamente para congelar las muestras. Además, el tejido cúbico congelado debe descongelarse inmediatamente antes del paso de homogeneización.
Las muestras de tejido congelado son adecuadas para otras aplicaciones posteriores, incluidas, por ejemplo, modificaciones del ensayo del cometa para detectar daños oxidativos o reticulaciones, y evaluación de cambios en la expresión génica. Se debe tener precaución durante el manejo de las cuchillas de bisturí para cortar o raspar los tejidos, y al manipular nitrógeno líquido durante el proceso de congelación.
