Novo Nordisk Fundación Centro para la investigación metabólica básica es un centro independiente de investigación en la Universidad de Copenhague, parcialmente financiado por una donación sin restricciones de la Fundación de Novo Nordisk.

1. tratamiento enzimático de la restricción
<ol><li>Alinear el mtDNA por tratar el DNA humana total con la enzima de restricción BamHI, que corta en la posición 14258 en el ADN mitocondrial humano. Nota: Para ADN de ratón, utilice la enzima de restricción BglII en condiciones idénticas como abajo.</li>
	<li>Para cada muestra donde metilación del mtDNA es evaluarse, preparar un tubo de reacción de 0.2 mL y añadir el siguiente mezcla: 3 μg ADN genómico (cuantificado por fluorometría), 15 μL tampón 3, 3 μL BamHI y agua hasta de 150 μL</li>
	<li>Colocar los tubos en un termociclador durante 4 h a 37 ° C.</li>
</ol>2. bisulfito conversión
<ol><li>Convertir el ADN BamHI-tratado con bisulfito de sodio como se describe en otra parte29.</li>
	<li>Utilizar 200-500 ng de ADN tratados con BamHI para cada reacción de conversión en un volumen total de 20 μL. La recuperación de ADN es 50-70%.</li>
	<li>Eluir la DNA bisulfito-convertido en tampón de elución de 10 μL.</li>
	<li>Cuantificar el ADN por fluorometría.</li>
	<li>Opcional: Almacenar DNA bisulfito-convertido a-20 ° C antes de continuar el resto del protocolo. Para el almacenamiento a largo plazo, almacenar DNA bisulfito-convertido a-80 ° C</li>
</ol>3. diseño de bisulfito de cebadores de secuencia
<ol><li>Diseño de iniciadores para la secuenciación de bisulfito usando las herramientas en línea Methprimer30 y31,de BiSearch32. Nota: Methprimer y BiSearch permiten para buscar secuencias de primer enlace en secuencias genómicas donde cytosines se convierten en thymines, semejantemente al bisulfito post tratamiento.</li>
	<li>Para la amplificación óptima e imparcial, evitar dinucleótidos CpG en las cartillas y diseñar el tamaño de amplicón entre 100-300 bp.</li>
	<li>Que sean diseñados primers específicos para el ADN mitocondrial usando la función de BiSearch Primer búsqueda. Inserte los cebadores ya diseñados bisulfito convertido, marque la casilla de bisulfito e incluyen un genoma de referencia y parámetros de la polimerización en cadena. Nota: Se mostrará una lista de posibles productos PCR.</li>
	<li>Copiar la parte superior de secuencias de la cartilla de 1-5 y pegar en un formulario de pedido para síntesis de oligonucleótidos. Nota: Una lista de los humanos y secuencias de la cartilla de mtDNA ratón que ha sido validado en el laboratorio se muestra en la tabla 1.</li>
	<li>Cartillas de prueba utilizando bisulfito convierten PCR después de electroforesis en gel de agarosa como se describe en el paso 4. Probar y optimizar por separado todos los pares de la cartilla y el tamaño de amplicón correcta aparece en el gel de agarosa. Nota: Si necesitan cebadores multiplexación, añadir cartillas múltiples a una sola reacción de PCR y visualizar los productos PCR en electroforesis en gel de agarosa o, un método más resolutivo como electroforesis en gel de poliacrilamida, para distinguir productos de similares tamaño.</li>
</ol>4. bisulfito convertido PCR y extracción del Gel
<ol><li>Para amplificar las regiones de interés, realizar PCR utilizando una polimerasa de Taq hot start. Brevemente, mezcla 100 ng convertido ADN, 500 μm cebadores sentido y anti-sentido, mezcla de dNTP 1 μl (10 μm de cada dNTP) y polimerasa en 7,5 U reacción en un volumen total de 50 μl. ejecutar PCR con las siguientes condiciones: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C, 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Utilizar cebadores ya sea por separado o multiplexados.</li>
	<li>Opcional: Al multiplexación cartillas, uso 200 ng convierte en ADN y las siguientes condiciones bicicleta: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Nota: La temperatura puede variar dependiendo de la temperatura de fusión de los primers.</li>
	<li>Productos PCR sujetos a gelificarse electroforesis en agarosa al 2% de 100 voltios.</li>
	<li>Bajo la suave luz de UV, extraer productos de PCR con un bisturí y añadir a microtubos. No exponga los productos PCR a la luz UV excesiva para evitar daños en el ADN. Evitar el tiempo de exposición de más de 30 s.</li>
	<li>Purificar los productos PCR usando gel de purificación como se describió anteriormente3.</li>
	<li>Cuantificar el ADN purificado de paso 4.5 mediante fluorometría. Proceda al paso 5 o del almacén de muestras a-20 ° C.</li>
</ol>5. secuencia biblioteca elaboración de bisulfito
<ol><li>Realizar la preparación de la biblioteca de productos PCR convertido a bisulfito. Opcional: múltiplex productos de PCR en esta etapa.</li>
	<li>Realizar reparación final con hasta 100 ng del producto de PCR. Agregar 3 μl final preparación enzima y 6,5 μl finales reparación reacción de tampón (10 x) a 55,5 μl del producto de PCR en un tubo de 0.2 mL. Lugar e incubar los tubos en un termociclador durante 30 min a 20 ° C, seguida por 30 min a 65 ° C.</li>
	<li>Ligan adaptadores de secuencia mezclando el ADN reparado final con 15 μl Blunt/TA ligasa mezclar, 2,5 μl adaptador y potenciador de la ligadura de 1 μl. Si utiliza < 100 producto PCR de ng como entrada, adaptador de diluir 10 veces.</li>
	<li>Colocar la mezcla (paso 5.3) en un termociclador e incubar 15 min a 20 ° C. Hacer una pausa en el termociclador y agregar 3 μl usuario enzima al tubo. Mezcla y vuelva a colocar el tubo en el termociclador e incubar 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Tamaño Seleccione el ADN ligada adaptador usando granos de sólido fase Reversible inmovilización (SPRI) con diferentes proporciones de granos al ADN dependiendo de tamaño del producto PCR.</li>
	<li>Añadir 13,5 μl de H2O a ADN ligada adaptador de paso 5.4 y 55 μl resuspendió SPRI granos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y lugar el tubo sobre un soporte magnético. Cuando la solución esté clara, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el tubo que contiene los granos. Nota: El sobrenadante contiene el ADN ligada adaptador y grandes fragmentos no deseados están limitados a los granos descartados.</li>
	<li>Añadir 25 μl resuspendió SPRI cuentas al sobrenadante del paso 5.6, mezclar e incube durante 5 min a temperatura ambiente. Coloque el tubo en el soporte magnético y descarte el sobrenadante cuando la solución es clara. Nota: El sobrenadante desechado contiene ADN no deseado, mientras que el ADN ligada por el adaptador está enlazado a granos.</li>
	<li>Mientras el tubo está en el soporte magnético, agregar 200 μL 80% de etanol (recién preparado) para lavar los granos. Incubar 30 s y quite y descarte el sobrenadante. Repita este paso para un total de 2 lavados.</li>
	<li>Aire seco granos durante 5 minutos mientras que el tubo está en soporte magnético con una tapa abierta.</li>
	<li>Retirar el tubo del imán, eluir el ADN en 23 μl de tampón de elución y mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre un soporte magnético y cuando la solución esté clara, transferir 2 μL en una placa PCR de 96 pocillos para la amplificación de pre-PCR (paso 5.14).</li>
	<li>Transferir el resto aproximadamente 21 μl a un nuevo tubo 0.2 mL para amplificación por PCR (paso 5.17). Nota: No olvide transfiera cualquier granos como granos pueden inhibir reacciones enzimáticas de los próximos pasos.</li>
	<li>Proceder a paso 5.14 o almacén de muestras a-20 ° C.</li>
	<li>Realizar la amplificación por RT-qPCR para estimar el número de ciclos necesarios para amplificar el ADN ligada adaptador pre-PCR. Por reacción, añadir lo siguiente en la PCR de 96 pocillos de la placa que contiene de 2 μl ADN (paso 5.11): 0,4 μL índice la cartilla, cartilla PCR universal de 0.4 μL, 7,2 μl de H2O, 10 μl RT-qPCR master mezclar.</li>
	<li>Colocar la placa en una máquina PCR en tiempo real y someter la placa a las siguientes condiciones: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 ciclos; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Estimar el número de ciclos de amplificación necesarios para cada muestra al restar un valor de Ct para el Ct-valor de la amplificación previa RT-qPCR correspondiente al final de la fase lineal de la reacción de PCR.</li>
	<li>Amplificar el ADN ligada adaptador de paso 5.12 mezclando: 21 μl ADN, 25 μl PCR master mix, 1 μl índice la cartilla, cartilla de PCR Universal de 1 μl y 2 μl de H2O. En un termociclador, tema cada muestra a las siguientes condiciones: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [Ct calculado en el paso 5.16] ciclos; 5 min 65 ° C. Nota: Recuerde utilizar solamente un primer índice por muestra para permitir la multiplexación. El índice se inserta durante la PCR.</li>
	<li>Purificar las cuentas SPRI ADN amplificadas y eluir en 22 μL de tampón de elución.</li>
	<li>Control de calidad de la biblioteca por gel electroforesis o alternativa método. Buscar tamaños de pico biblioteca correcta (tamaño de producto PCR más adaptador).</li>
	<li>Estimar el tamaño promedio de pares de base de los productos de la biblioteca por el análisis de frotis: en avanzada configuración global, haga doble clic en "tabla" bajo análisis de frotis. Definir la región de 100-1000 bp y haga clic en Aceptar. Debajo de la Mesa de la región, la región definida aparece y se calcula el tamaño promedio de la biblioteca (bp).</li>
	<li>Cuantificar las bibliotecas por fluorometría. Proceda al paso 6 o bibliotecas de tienda a-20 ° C.</li>
</ol>6. la siguiente secuencia de generación
<ol><li>Calcular la concentración de nM de bibliotecas mediante la fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Diluir las bibliotecas para el mismo nM de concentración por ejemplo de 2 nM (elegir 4 nM, 2 nM, 1 nM y 0,5 nM dependiendo de las concentraciones de la biblioteca). Todas las bibliotecas para conseguir una piscina de 2 bibliotecas nM de la piscina.</li>
	<li>Desnaturalizar y diluir las bibliotecas siguiendo la guía de instrumento de la secuencia. En Resumen: desnaturalizar la piscina nM 2 mediante la adición de 0.2 N NaOH e incubar a temperatura ambiente durante 5 min diluir la piscina desnaturalizada a una dilución final de 22:00. Desnaturalizar y diluir una biblioteca de Control disponible en el mercado a una dilución final de 12:05. A un tubo nuevo, mezcla de la piscina de 22:00 con la biblioteca de Control 20% 12:05. Nota: Conversión de bisulfito presenta muy baja complejidad. 20% control biblioteca spike en resultará en una mejor calidad de la secuencia.</li>
	<li>Ejecute una secuencia de extremo apareado de 150 bp usando un instrumento de secuenciación profunda.</li>
</ol>7. Computación Análisis - niveles de metilación de estimación
<ol><li>Generar archivos de .fastq (aquí llamados sample1_R1.fastq.gz y sample1_R2.fastq.gz), generar un índice de bismark de la totalidad del genoma de interés (aquí en una carpeta llamada bismarkIndex) y asegúrese de que la secuencia genomic de chrM está disponible en fasta formato (aquí en una carpeta llamada chrM).</li>
	<li>Procesamiento previo de Lee para eliminar el sesgo introducido por los iniciadores y adaptadores: utilizar la herramienta Trim_galore33. Quite dos nucleótidos del extremo 5' de Lee hacia adelante y hacia atrás. trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--trim1 - junto sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Alinee el preprocesado lee el genoma entero con Bismark34 Bismark, cola de pato - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Nota: Si se utiliza otro alineador, asegúrese de que dice que no puede ser alineado únicamente se descarta.</li>
	<li>Extracto de Lee traz al cromosoma M, utilizando aquí Samtools35 samtools tipo -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM samtools índice sample1_sorted.bam samtools ve -u sample1_sorted.bam chrM | samtools tipo - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Extraer la información de la metilación bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--completo--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Use el .bedGraph, la COV o los archivos de CX_report.txt para su posterior análisis. Utilice el archivo sample1_chrM.CX_report.txt para visualización y pruebas.</li>
	<li>Realizar más recortes en el paso de preprocesamiento, si varias regiones son interrogadas y un sesgo de la cartilla puede ser visible en las parcelas M-sesgo generadas durante la asignación. Consulte la documentación de Bismark para obtener más información.</li>
</ol>8. computación de análisis - prueba de las diferencias
<ol><li>Asegúrese de que el archivo CX_report.txt contiene 7 columnas, cromosoma (aquí chrM), posición, filamento, número de lecturas metilados, el número de lecturas unmethylated, C contexto y secuencia circundante, para cada C en el cromosoma M.</li>
	<li>Como la CX_report cubre chrM en su totalidad, compruebe el subconjunto a la región o regiones que se amplifica.</li>
	<li>Utilizar pruebas no paramétricas para las diferencias entre las muestras, como la prueba exacta de pescadores individuales c o una prueba de signo para toda la región. Nota: Cuantificación a menudo estará cerca de 0% de metilación, que es la razón por qué no es apropiado asumir normalidad.</li>
	<li>Del mismo modo, para la visualización, visualizar cuantiles o calcular intervalos de confianza de la proporción binomial.</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

Los autores tienen intereses financieros que compiten para declarar.

Presentamos un protocolo de secuenciación del bisulfito que está específicamente diseñado para interrogar a metilación del mtDNA. Las diferencias con la secuenciación del bisulfito de protocolos utilizados para la extracción de ADN genómico se encuentra en la utilización de un paso de digestión de la enzima de la restricción anterior y un análisis Bioinformático predominante hacia fuera falso positivo derivados NUMT secuencias.
Proporcionamos un protocolo para evitar artefactos de...

El genoma mitocondrial es una estructura circular, doble cadena de aproximadamente 16,5 kilos base (kb), lo que constituye de un pesado y un filamento de la luz. El genoma mitocondrial está presente en múltiples copias en cada célula, maternal heredado y codifica componentes esenciales de la cadena respiratoria complejos1. Similar a los genomas bacterianos y a diferencia del genoma nuclear, el genoma mitocondrial se organiza en numerosas estructuras secundarias y terciarias, como en las estructuras en espiral y superenrollado2, que puede hacer que acceso difícil durante la secuencia experimentos3.
En el núcleo, la metilación del ADN es una marca epigenética ampliamente estudiada que interviene en numerosos procesos, en particular en la regulación de la expresión génica. En genomas mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en la posición 5 del anillo de pirimidina de deoxycytidines, sobre todo en los dinucleótidos CG (o CpG). Metilación de la citosina se encuentra en el 70% de los CpG en el genoma de las células somáticas y ~ 1% del total que bases de ADN4. Metilaciones del ADN se ha descrito también en contextos no-CpG, CpC, CpA y CpT y existen en cantidades diferentes en el ADN nuclear, con valores de hasta un 25% de todos los cytosines metilados en células madre embrionarias5,6,7.
Mientras que la metilación de la citosina del genoma nuclear es ampliamente aceptada, la existencia de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial es aún controversial. La metilación de mtDNA investigadora primer estudio fue realizada en células cultivadas donde mtDNA metilación fue detectada fácilmente, aunque en niveles más bajos en comparación con el ADN nuclear8. En las células humanas y murinas, metilación del mtDNA también fue detectada en niveles bajos (2-5%). Usando análisis basándose en 5 METILCITOSINA captura como inmunoprecipitación de ADN metilada (MeDIP) seguida de PCR cuantitativa, metilación del mtDNA también fue detectada en varios ratón y humanos y células líneas9,10, 11,12. Usando los anticuerpos contra 5-METILCITOSINA en un ensayo ELISA o espectrometría de masas, niveles considerables de metilación del ADN fueron detectados de fracciones purificadas mitocondriales13,14,15, 16. sin embargo, la mayoría de los ensayos en los estudios antes mencionados utiliza técnicas que no fueron diseñadas para proporcionar la cuantificación absoluta de la metilación del ADN en la sola resolución de base.
Análisis de metilación de DNA cuantitativo y resolutivo puede lograrse mediante una técnica llamada "bisulfito de secuenciación", que se aprovecha de la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo en single-stranded DNA contexto17 . Mediante secuenciación de bisulfito, una constelación de estudios ha detectado la presencia de metilación de citosina en los distintos niveles. MtDNA de la metilación de la región D-loop, el 12S o la región 16S fue detectado fácilmente en humanos18,19,20,21,22,23 y ratón24 tejidos y células, sin embargo, con una variabilidad intrigante, de 1-20% del total cytosines en estudios.
En comparación con estos numerosos estudios, sólo unos pocos estudios, como de nuestro grupo, han disputado la presencia de mtDNA metilación3,25,26,27 o cuestionado la importancia biológica de niveles muy bajos de mtDNA (por debajo de 2%)28. Recientemente, informó de la observación de un artefacto de bisulfito de-secuencias posibles en todo mitocondrial bisulfito secuencia3. Proporcionamos evidencia que la estructura secundaria del ADN mitocondrial podría dar lugar a falsos positivos en secuenciación de bisulfito, así sobreestimar los niveles de metilación. Aquí proporcionamos un protocolo para evitar que un artefacto de bisulfito-conversión del ADNmt. Este protocolo utiliza una simple digestión enzimática del ADN para desarticular estructuras secundarias de mtDNA y permitir un acceso completo a siguiendo un protocolo de secuencia de bisulfito bisulfito. Además, ofrecemos un acompañamiento pipeline bioinformática para el análisis de secuenciación de bisulfito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

Cuantificación de la metilación del ADN puede lograrse utilizando secuenciación de bisulfito, que aprovecha la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo, en un contexto de ADN monocatenario. Secuenciación de bisulfito puede ser dirigida (mediante PCR) o en todo el genoma y proporciona la cuantificación absoluta de la metilación de la citosina en la sola base-resolución. Dada la naturaleza distinta del ADN nuclear y mitocondrial, en particular en la estructura secundaria, deben realizarse adaptaciones de métodos de secuenciación de bisulfito para la investigación de metilación de citosina en el ADNmt. Estructura secundaria y terciaria del mtDNA puede de hecho conducir a bisulfito de secuenciación artefactos llevando a falsos positivos debido a la deficiente acceso desnaturalización incompleta de bisulfito a ADN monocatenario. Aquí, describimos un protocolo con una digestión enzimática del ADN BamHI juntada con tubería de análisis bioinformáticos para permitir la cuantificación exacta de la citosina niveles de metilación en el ADNmt. Además, proporcionamos las pautas para el diseño de los cebadores de secuencia de bisulfito específicos de mtDNA, para evitar dirigidos a segmentos NUclear mitocondrial indeseables (NUMTs) insertan en el genoma nuclear.

Dos pasos en este protocolo son cruciales al investigar metilación del mtDNA. 1) la apertura de la estructura secundaria y 2) el diseño de iniciadores específicos de ADN mitocondriales.
Por digerir el ADN genómico humano con la enzima de restricción BamHI (figura 1), se reducirá la estructura del ADN mitocondrial en la posición del nucleótido 14.258 y se abrirá la estructura secundaria....

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K vistas.  University of Copenhagen. Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.

Video: Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Investigación

Genética

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...