Nos gustaría dar las gracias a la LRP Stiftung, en Triesen Liechtenstein, por apoyar financieramente nuestra investigación sobre el estrés oxidativo.

Estudios sobre ensayo cometa realizadas en la Universidad de Basilea, Departamento de Oftalmología fueron aprobados por el Comité Ético Local de Basilea 1. Preparación de los reactivos <ol><li> Prepare la solución mediante la adición de PBS (1 L de paquetes) y 990 ml de dH2O a los medios de comunicación Tampón fosfato salino de Dulbecco (PBS) (libre de Ca ++, Mg ++). Ajustar el pH a 7,4. Guarde a temperatura ambiente. </li><li> Preparar la solución de lisis: Para preparar 1000 ml Añadir NaCl 2,5 M (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) y 10 mM de base Trizma (1,2 g) en dH 2 O. </li><li> Preparar tampón de electroforesis (300 mM NaOH / EDTA 1 mM) mediante la adición de 30 ml de NaOH 10 M y 7,5 ml de 0,2 M EDTA, QS para 1500 ml dH 2 O y mezclar bien. El volumen total depende de la capacidad de la caja del gel. Antes de usar, medir el pH del tampón para asegurar un pH&gt; 13. </li><li> Preparar tampón de neutralización que contiene 0,4 M Tris (48,5 gm añadido a ~ 800 ml dH2O, ajustar el pH a 7,5), se concentró (&amp; #62; HCl 10 M) en 1000 ml con dH2O Guarde la solución a temperatura ambiente. </li><li> Prepare la solución de tinción. Para bromuro de etidio (EtBr; 10x Stock, 20 mg / ml) añadir 10 mg de EtBr en 50 ml dH2O y almacenar a temperatura ambiente. Para 1x Acción - mezclar 1 ml con 9 ml dH2O PRUDENTE! Maneje con precaución EtBr adecuada ya que es un carcinógeno conocido. </li></ol> 2. Aislamiento de leucocitos <ol><li> Obtener muestras de sangre humana (20 ml) con anti-coagulante tales como la heparina usando punción venosa. </li><li> Separar los linfocitos utilizando un separador de células en gradiente de densidad, tales como Histopaque. <ol><li> Brevemente, diluir la sangre en proporción 1: 1 con PBS o RPMI (sin FBS) y la capa de más de 600 l de líquido separador de células. </li><li> Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar el escudo &#39;Buffy&#39; en 3-5 ml de PBS / RPMI y se centrifugaron a 300 xg durante 10 min para sedimentar los linfocitos. </li><li> Recuperar los linfocitos desde justo por encima de límite entre PBS (RPMI) Y el líquido separador de células, utilizando una pipeta. Retire las bandas de leucocitos desde la interfaz entre el plasma y las capas líquidas separador de células de cada tubo y recoger en un tubo de 50 ml. </li></ol></li><li> Llevar el volumen total a 50 ml con medio Eagle modificado de Dulbecco frío (DMEM). Se lava la suspensión celular tres veces con DMEM a 300 xg durante 10 min. </li><li> Cuente el número total de células utilizando un hemocitómetro. Suspender las células en PBS y alícuotas en tubos de microcentrífuga a 10 7 células / tubo. </li><li> Pipetear 0,4 ml de células en un tubo de plástico desechable de 5 ml. Añadir 1,2 ml 1% de agarosa de baja temperatura de gelificación a 40 ° C. Mezclar y rápidamente y pipetear 1,2 ml de suspensión celular sobre la superficie de agarosa-cubierto de un portaobjetos pre-recubiertos. Evitar la producción de burbujas. </li><li> Deje que el gel de agarosa al por alrededor de 2 min. Sea consistente con el tiempo y la temperatura utilizada para la gelificación, y asegúrese de que agarosa está totalmente ajustado antes de sumergirse en la solución de lisis. Después plenamente set, sumergir en solución de lisis a ~ 4 ºC. </li></ol> 3. Lisis y Electroforesis NOTA: El procedimiento descrito es para la electroforesis en condiciones de pH&gt; 13 alcalinas. <ol><li> Después de al menos 2 horas a ~ 4 ºC, retire con cuidado los portaobjetos de la solución de lisis. Lugar desliza de lado a lado en la caja de gel horizontal cerca de un extremo, deslizándolas tan cerca como sea posible. </li><li> Llenar los depósitos tampón con tampón de pH&gt; 13 electroforesis recién hecho hasta que el nivel del líquido cubre completamente las diapositivas (evitar burbujas sobre la agarosa). </li><li> Deje diapositivas se sientan en el tampón alcalino durante 20 min para permitir el desenrollamiento del ADN y la expresión de daños alcalino-lábil. </li><li> Encienda la fuente de alimentación de 25 voltios (~ 0,75 V / cm) y ajustar la corriente de 300 miliamperios subiendo o bajando el nivel de amortiguación. La electroforesis los portaobjetos durante 30 min. </li><li> Desconecte la alimentación. Levante con cuidado las diapositivas de la memoria intermedia y pencaje en una bandeja de drenaje. Caída de la capa sabia las diapositivas con la neutralización de búfer. Permitir a las diapositivas para sentarse durante al menos 5 minutos. Escurrir las diapositivas y repetir dos veces más. </li><li> Teñir las diapositivas con 80 l 1x bromuro de etidio (EtBr) y dejar actuar durante 5 minutos y luego se sumerge en agua destilada fría para eliminar el exceso de tinte. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y almacenarlos inmediatamente. Tienda desliza durante un mes a temperatura ambiente en un lugar seco. NOTA: Otras manchas de ADN (por ejemplo, SYBR-verde) puede también ser utilizado. ¡Precaución! usar guantes protectores como la mayoría de los tintes son mutagénicos. </li></ol> 4. Cuantificación de ADN Breaks <ol><li> Para visualizar el daño en el ADN, observar la diapositiva ADN teñido con EtBr bajo un microscopio de fluorescencia objetivo de 40X. </li><li> Evaluar cuantitativamente el daño del ADN en las células mediante la medición de la longitud de la migración del ADN y el porcentaje de ADN migrado (Figura 1A). Cuantificar el daño del ADN (Figura 1B) por el momento cola- y Olive-moment. Definiciones de Cola-Momento y Olive -Moment previamente se les ha dado 8-10. NOTA: En nuestra experiencia es suficiente para pegarse por uno de los parámetros. Las células son fotografiadas mediante el establecimiento de la herramienta automatizada que escanea sobre las células portaobjetos de microscopio y fotografías. Cuantificación de roturas en el ADN se puede hacer por paquetes de software de análisis de imagen. Hay varios paquetes de software diferentes que se hacen de encargo para capturar la imagen de las células y cuantificar el daño del ADN. Se recomienda utilizar el mismo paquete de software de todo el experimento. El técnico de laboratorio identifica la célula intacta o un cometa que se anotaron en el equipo y hace clic con el ratón sobre ella. La célula cometa o intacta después se anotó de forma automática. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. 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P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

Científicos suecos Ostling y Johanson fueron los primeros en su campo para utilizar ensayo cometa para cuantificar el daño del ADN en las células 1. Las condiciones neutras que los dos científicos utilizaron, sin embargo, sólo se permite la detección de roturas de doble cadena de ADN. Singh et al. Más tarde adaptó el ensayo para su uso en condiciones alcalinas, que produjo una versión sensible que podría evaluar roturas de doble y de cadena simple de ADN y detectar sitios álcali-lábiles 12. Desde su desarrollo inicial, el ensayo ha sido modificado en varias etapas para que sea adecuado para la evaluación de los tipos de daño en el ADN en diferentes tipos de células 13-15. Al igual que con todas las técnicas, prestando una atención rigurosa a los detalles técnicos, es importante para obtener resultados precisos 16. Basándonos en nuestra experiencia, se obtienen mejores resultados si cada paso de la preparación metodológica solución al cometa cuantificación se realiza por expertos techn laboratorioicians. El uso de medio fresco y preparado correctamente, las técnicas adecuadas de pipeteo, la temporización exacta y (como se mencionó anteriormente en la sección de resultados) el uso de leucocitos recién preparados son esenciales para que la lisis y la electroforesis en gel para obtener resultados precisos 17. Todos los pasos individuales en este ensayo son igualmente importantes para la obtención de resultados fiables. 16 En los mejores resultados generales se obtienen si cada paso metodológico sencillo de preparación de la solución hasta la cuantificación cometa se realiza technicians.Important laboratorio experto parecen el uso de medios frescos y correctamente preparados , técnicas de pipeteo adecuadas, fecha exacta y como ya se hace referencia en la sección de resultados del uso de los leucocitos recién preparados para la lisis y la electroforesis en gel para obtener resultados adecuados del ensayo de 17. Como hacer otras metodologías, la técnica de ensayo cometa tiene su advanventajas y desventajas. Al ser un método sensible, el ensayo es vulnerable a los factores (por ejemplo, luz UV), que podría aumentar roturas en el ADN y por lo tanto afectar los resultados. Cualquier factor que puede aumentar el estrés oxidativo, excepto lo que se está investigando, se debe evitar. Los factores estresantes pueden aumentar el nivel de estrés oxidativo no sólo en los leucocitos, sino también en todos los demás medios de sangre y linfocitos. Como se mencionó anteriormente, hay muchas maneras diferentes y más directas de medir el estrés oxidativo 18,19. El ensayo cometa es uno de los muchos métodos que tiene ciertas ventajas. Estos incluyen su bajo costo relativo, el pequeño número de células requeridas (&lt;10 000 células) y así las pequeñas muestras de sangre requeridas por paciente, el período relativamente corto de tiempo requerido para cuantificar el daño del ADN en las células (aproximadamente 3 días), su sensibilidad y su extendida aplicabilidad al daño del ADN asnos en diferentes tipos de células. En el pasado hemos elegir trabajar con leucocitos ya que teníamos experiencia con estede tipo celular y era aplicable para el estudio particular previsto. Otra ventaja del ensayo cometa es que puede ser utilizado para detectar diferentes tipos y niveles de daño del ADN y por lo tanto se puede aplicar en varias otras áreas de estudios, además de estrés oxidativo, tales como estudios de reparación del ADN, ensayos de suplementación o estudios de genotoxicidad. El estrés oxidativo es ahora reconocido como jugando un papel crítico en la patogénesis de múltiples enfermedades. El método de ensayo de cometa, mientras que una de las muchas formas de medir el estrés oxidativo 18,19, es relativamente simple, versátil y barato. Cuando dominado, este método se puede utilizar en todas las áreas de la medicina en la que el estrés oxidativo juega papel 8-10,20,21.

Ensayo cometa fue desarrollado por primera vez por científicos suecos Ostling y Johanson 1. El ADN es una molécula cargada negativamente. Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN más pequeñas, dañadas viajan más rápido hacia un ánodo cargado positivamente 2. El más pequeño de los fragmentos de ADN, más rápido su migración hacia el ánodo para formar un &quot;cometa&quot; típico con una &quot;cabeza&quot;, compuesto por intacta, el ADN dañado y una &quot;cola&quot;, compuesto de fragmentos de ADN dañadas 3. ADN dañado puede ser reparado por diferentes mecanismos en el cuerpo 4, que mantienen la generación de ADN se rompe bastante equilibradas 5. Sin embargo, si el saldo es a favor de ADN se rompe, se rompe se acumulan y en última instancia, contribuir al desarrollo de una enfermedad. Nuestro ADN sufre aproximadamente 0.000165% de daños en un momento dado 6. Breaks ADN monocatenario se refieren a un defecto en una de las dos hebras de la doble hélice de ADNmientras que las pausas de doble cadena de ADN son causadas cuando las dos cadenas de la doble hélice de ADN están dañados. Hay varios factores que pueden aumentar la cantidad de roturas en el ADN en un momento dado, como la edad de la célula, el humo del cigarrillo, diversos fármacos o el estrés oxidativo 7-9. Si se mantienen constantes todos los factores que conducen a roturas en el ADN mejoradas, a continuación, la cuantificación de ADN se rompe por medio del ensayo cometa es un buen parámetro indirecto del estrés oxidativo. El método de ensayo cometa se utiliza cada vez más hoy en la medicina incluyendo oftalmología. Una razón para esto es que el estrés oxidativo es más y más reconocido como un mecanismo patogénico para diversas enfermedades 8-11 y ensayo cometa es un método con el que el estrés oxidativo se puede cuantificar indirectamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Organismos eucariotas superiores no pueden vivir sin oxígeno; sin embargo, paradójicamente, el oxígeno puede ser perjudicial para ellos. La molécula de oxígeno es químicamente relativamente inerte porque tiene dos electrones desapareados ubicados en diferentes orbitales pi * anti-unión. Estos dos electrones tienen espines paralelos, lo que significa que giran en la misma dirección alrededor de sus propios ejes. Esta es la razón por la molécula de oxígeno no es muy reactivo. La activación de oxígeno puede ocurrir por dos mecanismos diferentes; ya sea a través de la reducción a través de un electrón en un momento (reducción monovalente), o mediante la absorción de energía suficiente para invertir el giro de uno de los electrones desapareados. Esto resulta en la producción de especies oxidativas reactivas (ROS). Hay un número de maneras en que el cuerpo humano elimina ROS en su estado fisiológico. Si la producción de ROS supera la capacidad de reparación, los resultados de estrés oxidativo y los daños de diferentes moléculas. Hay muchos métodos diferentes por los que el estrés oxidativo puede ser míasured. Este manuscrito se centra en uno de los métodos llamados electroforesis en gel de célula, también conocido como &quot;ensayo cometa&quot;, que permite la medición de roturas en el ADN. Si se mantienen constantes todos los factores conocidos para causar daño en el ADN, que no sea el estrés oxidativo, la cantidad de daño en el ADN medido por el ensayo de cometa es un buen parámetro de estrés oxidativo. El principio es simple y se basa en el hecho de que las moléculas de ADN están cargadas negativamente. Una molécula de ADN intacto tiene un tamaño tan grande que no migra durante la electroforesis. Roturas en el ADN, sin embargo, si está presente resultado en fragmentos más pequeños que se mueven en el campo eléctrico hacia el ánodo. Los fragmentos más pequeños migran más rápido. Como los fragmentos tienen diferentes tamaños el resultado final de la electroforesis no es una línea distinta, sino más bien un continuo con la forma de una cometa. El sistema permite una cuantificación de la &quot;cometa&quot; resultante y por lo tanto de las roturas en el ADN en la célula.

Aunque el método de ensayo cometa hace resultados reproducibles, puede ser influenciada por una variedad de factores. Uno de estos factores es si o no los leucocitos son crioconservados antes de la lisis y la electroforesis en gel o si este paso se lleva a cabo en los leucocitos recién preparados. La Figura 2 muestra que en el Grupo 2, donde los leucocitos fueron crioconservados antes de la lisis de ADN y electroforesis en gel de SS- roturas fueron significativamente más altos, que en el Grupo 1, donde la lisis y gel -electrophoresis se realizó en las células recién preparadas. El ensayo también se puede utilizar para evaluar indirectamente el estrés oxidativo sistémico. La Tabla 1 muestra los estadísticos descriptivos de cola- momento y momento oliva en fumadores y sujetos sanos. Los datos revelan que fumar medio paquete de cigarrillos al día más que duplica descansos ssDNA en los leucocitos circulantes 9. <img alt="Figura 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figura 1. (A) Representa el microscopio utilizado durante el análisis de ensayo cometa. (B) Δ representa a un &quot;cometa&quot; típico con una cabeza brillante y la cola (dañado fragmentos de ADN más pequeños). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figura 2. rompe ssDNA fueron significativamente más altos cuando los leucocitos fueron crioconservados (Grupo 2) que cuando se utilizaron los leucocitos recién preparadas antes de la lisis y la electroforesis en gel. <imgalt = &quot;Tabla 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabla 1. Los fumadores tenían más del doble del número de ssDNA rompe en comparación con la edad y el sexo emparejado sanos no fumadores.

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Ensayo cometa mide roturas en el ADN, inducidas por diferentes factores. Si se mantienen constantes todos los factores (excepto el estrés oxidativo) que causan daño en el ADN, la cantidad de daño en el ADN es un buen parámetro indirecto de estrés oxidativo. El objetivo de este protocolo es usar ensayo cometa para la medición indirecta de estrés oxidativo.

Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.1K vistas.  University of Basel.  Ensayo cometa mide roturas en el ADN, inducidas por diferentes factores. Si se mantienen constantes todos los factores (excepto el estrés oxidativo) que causan daño en el ADN, la cantidad de daño en el ADN es un buen parámetro indirecto de estrés oxidativo. El objetivo de este protocolo es usar ensayo cometa para la medición indirecta de estrés oxidativo. 

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Investigación

Biología

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

La aplicación de un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA ensayo de protección de visualizar Estrés Mediación propiedades de la proteína Dps

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Un análisis de la competencia la placa como una evaluación preliminar rápida de supresión de la enfermedad

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...