Los autores agradecen a la Fundación Bill y Melinda Gates, por su apoyo al desarrollo de la tecnología y la formación.

Nota: Este protocolo incluye volúmenes y concentraciones de placa de 96 pocillos, tiras de 8 tubos, y los sistemas basados ​​en capilares (volumen de reacción de 10 l); Sin embargo, HRM también se puede realizar en sistemas basados ​​en placa de 384 pocillos con un volumen de reacción de 5 l escalando todos los volúmenes correspondientemente. El rango de detección para la mayoría de los sistemas es de 10 pg a 10 ng de ADN plantilla. 1. Preparar plantillas <ol><li> Obtener muestras de Plasmodium falciparum directamente de la sangre obtenida a partir de pacientes que participan en estudios sitio de campo y se almacena como sangre completa, glóbulos rojos sedimentadas, o sobre papel de filtro. Nota: Las muestras también pueden ser cultura-adaptado para crecer in vitro; algunas cepas estándar de laboratorio para su análisis se pueden pedir desde el Centro de Recursos para la Investigación y Referencia Reactivo Malaria (MR4, muestras se pueden usar directamente de glóbulos rojos o la cultura sedimentadas o extraídos de la sangre total, glóbulos rojos, o el papel de filtro. </li><li> ADN extraído depapel de filtro o cepas de cultivo adaptadas Nota: HRM es sensible a la concentración de sal; diferencias de concentración debido a los métodos de extracción variables pueden afectar significativamente las temperaturas de fusión. Mientras buffers finales específicos no son un factor importante para el éxito, utilizar una elución o resuspensión tampón estándar común (es decir, agua, 1x Te [&#39;baja Te&#39; o &#39;tampón de suspensión de ADN&#39;: 10 mM Tris-Cl, EDTA 0,10 mM] o 1x TE [10 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM]) para todas las muestras para evitar las curvas de fusión anómalas o inconsistentes. <ol><li> Preparar diluciones plantilla de 10 pg -10 ng por l en la norma Te, TE o agua para cada reacción de 10 l. </li></ol></li><li> La amplificación directa de los glóbulos rojos sedimentados <ol><li> Determinar la parasitemia de los glóbulos rojos mediante microscopía de frotis delgado Nota: Los métodos para determinar la parasitemia de los glóbulos rojos infectados se encuentran disponibles en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Diluir parasitemias por encima de 0,5% 1: 400 en PCR grado agua, TE, o Te. Utilice 3 l para cada 5- 10 l de reacción. </li></ol></li><li> Controles Nota: HRM se puede utilizar para el escaneado gen para detectar variantes de la secuencia en una población 12; Sin embargo, el genotipado precisa requiere siendo interrogado normas secuencia verificada para contener el SNP. Constructos de plásmido o malaria aislamientos con genotipos conocidos pueden ser utilizados. Para la mayoría de aplicaciones, 3D7 (MR4 MRA-151) se utiliza como un control de tipo salvaje. Debido a la variabilidad entre las carreras, siempre incluyen controles positivos y negativos. <ol><li> Los controles positivos: Prepare 10 pg - 10 ng por 1 mu l diluciones de plásmido o normas con genotipos SNP secuencia verificada. </li><li> Control negativo: agua de calidad de uso PCR como un control sin plantilla (NTC) para las reacciones de amplificación. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Amplificación por PCR <ol><li> Preparar mezcla de reacción <ol><li> Capa de aceite (opcional) Mineral. Nota: Algunos sistemas de gestión de recursos humanos son plataformas de fusión independientes y no tienen una tapa térmica para evitar la condensación y la evaporación del producto durante la amplificación. <ol><li> Añadir 20 l de aceite mineral ligero a cada placa bien antes de cargar la mezcla de reacción. </li></ol></li><li> Preparar 10x stocks de trabajo de todos los ensayos <ol><li> Consulte la Tabla 1 para 10x concentraciones de valores de trabajo recomendadas, así como concentraciones finales de genotipado HRM basada en sondeos bloqueado. </li></ol></li><li> Preparar las mezclas de reacción <ol><li> A cada pocillo de la placa o tubo, añadir 1 l de 10x madre de trabajo adelante y cebadores y sondas, 4,0 inversa - 2,5x o 2,0x HRM mezcla 5,0 l maestro, 1 l de plantilla, y el agua de grado PCR para un volumen total de reacción de 10 l . </li></ol></li><li> Pestillo o tubos <ol><li> Utilice óptica placa sEALS para la amplificación basada en la placa, tapones ópticos para los sistemas basados ​​en la tira de Tubo y tapones de plástico para sistemas basados ​​en capilares. Sé cobertura de seguro es completa y platos y tapas están completamente sellada y asegurada para evitar la evaporación durante la amplificación. </li></ol></li><li> Muestras de Spin <ol><li> Placas de Spin 3 min a 1800 xg para eliminar burbujas de aire y para separar las fases oleosa y acuosa si se usa aceite mineral. </li></ol></li></ol></li><li> Protocolo de amplificación <ol><li> Colocar placas de reacción o tubos en el termociclador. Protocolos sonda bloqueada o MAAB amplificación estándar Ejecutar (Tablas 2 y 3, respectivamente). Tenga en cuenta la diferencia en la temperatura de recocido entre estos métodos. </li></ol></li></ol> Análisis 3. HRM <ol><li> Derretir <ol><li> Después de la amplificación por PCR, continúe con el análisis de fusión. Para sistemas de fusión independientes que no se han incorporado en la amplificación (por ejemplo., Sistemas BIOFIRE Defensa LightScanner), remover la placa amplificado de termociclador y colocar en instrumento de gestión de recursos humanos. Desde la interfaz de software del sistema, fundir la placa de la 40 - 80 ° C para producir tanto la sonda de amplicón y picos de fusión. Nota: Para guardar fusión y análisis de tiempo, la ventana de fusión se puede acortar para cubrir los rangos de temperatura por sólo sondear o regiones de fusión amplicón. Después de la fusión, las placas y los tubos pueden ser re-fundieron si es necesario y se almacena a -20 ° C o 4 ° C. Tubos de vidrio Conservar sólo a 4 ° C para evitar que los tubos se agriete. </li></ol></li><li> Análisis Melt <ol><li> Retire las muestras negativas <ol><li> Dentro del software de análisis, retirar de nuevas muestras de análisis que no amplificar o que tienen picos de fusión dentados. Nota: Después de seleccionar el modo de análisis de un archivo de ejecución individuales, el instrumento automáticamente grupos de las muestras positivas y negativas. Antes de genotipificación de cada subconjunto, el usuario puede alterar manualmente las llamadas. <ol><li> Ya sea de la fusióncurva o pico de fusión vista, haga clic en las curvas para ser removido para seleccionarlos. Después de seleccionar las muestras mal clasificados, vaya a &quot;Nueva llamada&quot;, seleccione la agrupación apropiada y haga clic en &quot;Aplicar Cambio&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalizar <ol><li> Desde el derivado negativo de fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura (-df / dT) (&#39;Curvas diferencia &quot;) visión, mover las barras de normalización para rodear la sonda fundir región. Nota: La sonda se funden región es la temperatura más baja de las dos regiones de fusión. Las barras de normalización deben estar en la base de los picos de fusión. </li></ol></li><li> Calcular los grupos <ol><li> Después de la normalización, seleccione &#39;Calcular grupos&#39; para asignar automáticamente las muestras a los grupos. Si es necesario muestras, a asignar volver manualmente a grupos específicos. Nota: Algunos programas de análisis tiene umbrales de alta sensibilidad que no se pueden cambiar; en estos casos, la software podría asignar muestras a diferentes grupos que pertenecen visualmente a otra. </li></ol></li><li> Asignar genotipos <ol><li> Asignar genotipos para cada grupo basado en estándares (controles positivos). <ol><li> Después de que el usuario confirma que los grupos calculados son correctos (si no es así, que los cambios correctos se han hecho en la pestaña Agrupación seleccionando muestras mal clasificados y seleccionando el grupo desde el primer cuadro desplegable al lado de &quot;Nueva llamada&quot;), seleccione &quot;Editar nombres de grupo &quot;bajo la pestaña&quot; Agrupación &quot;. </li><li> Introduzca los genotipos de las normas en el cuadro de color correspondiente (por ejemplo, si 3d7 estándar tiene un conocido Un genotipo y está en el grupo rojo, el grupo rojo tiene el genotipo A). Pulse el botón &quot;Aceptar&quot; y guardar los resultados. </li></ol></li></ol></li><li> Exportación de resultados <ol><li> Genotipo Exportación llama como una hoja de cálculo para su posterior análisis muestra de población. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Continua HRM es una etapa de análisis post-PCR; Por lo tanto, la muestra y la configuración de ensayo es similar a protocolos de PCR estándar, con la incorporación adicional de un colorante intercalante fluorescente utilizado para rastrear la transición de doble cadena a ADN monocatenario durante la etapa de fusión de alta resolución. El factor más importante para el análisis de gestión de recursos humanos con éxito es un producto de PCR robusto. Diseño del ensayo es la clave, y varias herramientas optimizadas para el diseño de ensayo de gestión de recursos humanos están disponibles en el mercado y en línea 13. Longitudes de amplificación de 80-150 pares de bases con el acompañamiento de ~ 20 pares de bases bloquearon sondas sobrevolaron el SNP o SNP de interés el trabajo mejor para diferenciar SNPs y haplotipos de múltiples SNPs dentro de la región de la sonda. Las sondas pueden ser bloqueados usando un 3 &#39;C3 espaciador o un par desajuste 2 de base en el extremo 3&#39;, que impiden la extensión durante la amplificación. Las sondas se pueden diseñar para que coincida con la cadena de Watson Crick o plantilla; la eleccióndepende de la comprobación empírica para determinar qué sonda de diseño produce picos de fusión aceptables. El exceso hacia delante o hacia atrás primers se utilizan para producir producto de amplificación de cadena sencilla que hibrida con las sondas bloqueadas. Si la sonda contiene la secuencia de la cadena hacia adelante, luego cebador inverso se utiliza en exceso, por lo general en una proporción de 1: 5, y viceversa para las sondas que coinciden con la cadena inversa. Del mismo modo, HRM funciona mejor con suficiente y robusto producto de PCR. La optimización de la reacción PCR requiere geles de gradiente de PCR y análisis de agarosa o Bioanalyzer para determinar la temperatura óptima de recocido. Plantilla de concentración se puede aumentar usando métodos tales como pre-amplificación, la amplificación multiplexado sesgada de todos los objetivos utilizando concentración del cebador bajo y números de ciclo para aumentar la concentración de molde 13. Sólo un puñado de instrumentos son compatibles con MAAB. Las propiedades térmicas de los tubos capilares de vidrio usado in estos sistemas facilitan este método. El pequeño diámetro interior de los capilares, así como la rápida transferencia de calor a través del vidrio ofrecen un control de temperatura más riguroso que plasticware PCR estándar, que tiene tasas de transición más lentas de recocido entre ciclos de desnaturalización y debido a las propiedades de aislamiento térmico de los plásticos. Con este método, las sensibilidades de detección pueden reducirse a partir de 2-5% a menos del 1% de un alelo mutante en una mezcla de tipo salvaje y los alelos mutantes 10. Gestión de recursos humanos es una herramienta fácil, eficiente y económica para SNP genotipo en una variedad de configuraciones y numerosas aplicaciones, desde la vigilancia de enfermedades infecciosas para la exploración de variantes genéticas del cáncer. Varios otros instrumentos, como la Roche Nano y sistemas LightCycler (480 y 96), así como el Eco en tiempo real ofrece el sistema PCR HRM, además de la amplificación estándar, en tiempo real, y la funcionalidad de número de copias. El uso de máquinas de alto rendimiento, cuesta códigos de barras gestión de recursos humanos less de $ 0.50 por ensayo en nuestras manos, que incluye todos los reactivos y consumibles. En el contexto descrito aquí, las aplicaciones basadas en el terreno permiten la vigilancia de la población en tiempo real para los cambios asociados con los esfuerzos de control de la malaria, incluyendo reducida diversidad de la población, la detección de tipos de parásitos importados, y la aparición y propagación de SNPs asociados con una menor sensibilidad a los fármacos. Perfeccionamiento del método ofrecen sensibilidad adicional útil para informar el progreso hacia la eliminación de la malaria y erradicación.

A pesar del renovado interés en el control de la malaria y la erradicación, la malaria sigue siendo una carga para todo el mundo, con casi la mitad de la población mundial corre el riesgo de infección y más de 550.000 muertes al año, en particular los niños en África subsahariana 1. Estos nuevos programas de control y erradicación han sido apoyados por el renacimiento genómico, con un gran número de parásitos de la malaria secuenciados y analizados por mutaciones asociadas con una menor sensibilidad a los fármacos, el aumento de la virulencia y de características de la población 2,3. Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son algunas de las variantes genéticas más comúnmente identificados 4-7. Métodos portátiles genotipado de SNP ofrecen en el establecimiento y vigilancia de la población y en tiempo real el seguimiento de 8. Además de las huellas digitales de los parásitos individuales, el &quot;código de barras molecular también se utiliza para detectar cambios temporales dramáticos en frecuencia de los alelosasí como la variación del tamaño efectivo de la población y la complejidad de la infección 9. Si bien este conjunto de informativo SNPs se adapta fácilmente a muchas plataformas de genotipado, de alta resolución de fusión (GRH) análisis está particularmente bien adaptado a los estudios, en el funcionamiento y la detección de nuevas mutaciones en los bajos costos sensible y simple en comparación con la secuencia y otro campo de base enfoques son atractivos en entornos de escasos recursos. HRM comienza con la reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR) que incorpora un colorante fluorescente. Post-PCR análisis de fusión determina la temperatura máxima amplificación de fusión; una única diferencia de SNP en un corto amplicón puede resultar en sustancial de temperatura pico de fusión (Tm) diferencias. Varias mejoras a este método ofrecen mejor resolución genotipado para diferenciar SNPs incluidos SNPs clase IV (AT), y detectar alelos mutantes de menor importancia en las muestras con múltiples alelos presentes (poliGinfecciones enomic). En primer lugar, los ensayos incorporan sondas cortas centrado sobre la región SNP, además de cebadores directo e que están presentes en diferentes concentraciones revertir. Estas sondas bloqueados no se amplifican durante la PCR, pero se unen a la cadena producida en exceso debido a concentraciones de cebador asimétricos que aumentan la producción del producto sonda de plantilla. Estos amplicones de doble cadena separados formados por sonda unida al exceso cadena molde son ~ 20-30 pb; su longitud disminuyó significativamente en comparación con todo el amplicón (de 80-150 pb) conducen a diferencias mucho más grandes Tm asociados con la base única o múltiple sonda de plantilla desajustes 10. En segundo lugar, el sesgo de amplificación alelo mutante (MAAB) reduce la temperatura de recocido reacción al sesgo la reacción hacia alelos mutantes presentes en bajas proporciones en las infecciones polygenomic. La temperatura de hibridación se establece entre las Tms de perfectamente coincidente (de tipo salvaje) y coinciden sonda (mutante)s. A esta temperatura, la unión del alelo de tipo salvaje es lo suficientemente estable que la amplificación se ve obstaculizado en comparación con su falta de coincidencia equivalente, sesgando así la amplificación hacia el alelo mutante cuando ambos están presentes en una sola muestra 10. Con estos refinamientos HRM, esta tecnología ha permitido el seguimiento de los orígenes y la identidad de parásitos asociados con infecciones epidémicas en América del Sur 11 y la detección de nuevas mutaciones, diferenciación de múltiples SNPs situados inmediatamente uno junto al otro en secuencia, y las mutaciones presentes en menos de 1 % de los alelos en muestras polygenomic 10. Aumento de la sensibilidad es particularmente importante en las regiones que se acercan estado de pre-eliminación y aquellos en riesgo de emergente resistencia a los medicamentos. La capacidad para identificar rápida y fácilmente los parásitos y SNPs importados asociados con una menor sensibilidad en el sitio informa los esfuerzos de vigilancia y los programas de control sobrela efectividad de sus implementaciones e identifica puntos de acceso para mayores esfuerzos de erradicación de la malaria y de eliminación. Este protocolo describe los métodos para la sonda bloqueado con sede y MAAB para una mayor sensibilidad genotipado HRM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

A pesar de décadas de esfuerzos de erradicación, la malaria sigue siendo una carga global. Renovado interés reciente en la eliminación regional y la erradicación mundial se ha visto acompañado por un aumento de la información genómica sobre Plasmodium especies de parásitos responsables de la malaria, incluyendo características de las poblaciones geográficas, así como las variaciones asociadas con susceptibilidad reducida a los medicamentos contra la malaria. Una variación genética común, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), ofrece objetivos atractivos para el genotipado parásito. Estos marcadores son útiles no sólo para el seguimiento de los marcadores de resistencia a los medicamentos, sino también para el seguimiento de las poblaciones de parásitos utilizando marcadores no menores de drogas u otras presiones selectivas. Métodos de genotipificación de SNP ofrecen la posibilidad de realizar un seguimiento de resistencia a los medicamentos, así como tomar las huellas dactilares parásitos individuales para la vigilancia de la población, sobre todo en respuesta a los esfuerzos de control de la malaria en regiones acercan Eliminatestado iónico. Mientras SNPs informativos han sido identificados que son agnósticos a las tecnologías de genotipado específicos, de alta resolución de fusión (GRH) análisis es especialmente adecuado estudios basados ​​campo-a. En comparación con los métodos estándar fluorescente sonda basados ​​que requieren SNPs individuales en una sola sonda marcada y ofrecen, en el mejor 10% de sensibilidad para detectar SNPs en muestras que contienen múltiples genomas (polygenomic), gestión de recursos humanos ofrece 2.5% de sensibilidad. Modificaciones a HRM, tales como sondas bloqueadas y concentraciones de cebador asimétricos, así como la optimización de temperaturas de recocido de amplificación para PCR sesgo hacia la amplificación de la alelo menor, aumentar aún más la sensibilidad de HRM. Aunque la mejora de sensibilidad depende del ensayo específico, hemos aumentado la sensibilidad de detección a menos del 1% del alelo menor. En las regiones se acercan a la erradicación de la malaria, la detección temprana de emergentes o resistencia a los medicamentos importados es esencial para la prrespuesta OmpT. Del mismo modo, la capacidad de detectar infecciones polygenomic y diferenciar tipos de parásitos importados de embalses locales crípticas puede informar a los programas de control. Este manuscrito describe modificaciones a la tecnología de fusión de alta resolución que aumentan aún más su sensibilidad para identificar infecciones polygenomic en muestras de pacientes.

Los datos pueden ser visualizados en varias maneras diferentes, dependiendo del software de análisis y el instrumento. Típicamente, un gráfico de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura (-df / dT) contra los resultados de temperatura es más sencilla para la visualización de picos de fusión y la determinación de los genotipos. Una ventana de fusión completa (40 ° C-80 ° C) resultará en ambas regiones de amplicón y de fusión de la sonda. La Figura 1 muestra un ejemplo de picos de fusión normalizados para ambas regiones. Configuración de la ventana de análisis sólo a los resultados de la región de la sonda en la diferenciación clara de picos correspondientes a SNPs específicos (Figura 2). Análisis basado-Probe muestra claramente la presencia de ambos alelos como picos individuales con temperaturas de fusión que coincidan con los picos de SNP homocigóticos (Figura 3). La Figura 4 muestra que progressively reducir la temperatura de recocido durante la amplificación (MAAB) da como resultado un sesgo hacia el alelo mutante (pico-lado izquierdo) (Figura 4A), lo que resulta en aumento de la sensibilidad para el alelo mutante en una población de alelos mixtos (Figura 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figura 1. sonda y de fusión amplicón regiones. Trazado de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura en un amplio resultados de la ventana de fusión en tanto la sonda (temperatura más baja) y picos de fusión amplicón que pueden ser analizados. (Adaptado de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2. Probe picos de fusión. Partidos perfectos (típicamente alelos de tipo salvaje) dar lugar a picos de fusión más altos (rojo), mientras que los desajustes SNP tienen temperaturas de fusión más bajos (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figura 3. Polygenomic picos de fusión. Cuando ambos alelos están presentes en una muestra, el análisis de gestión de recursos humanos basados ​​en sonda representa ambos alelos como curvas de dos picos (naranja) con picos que responden a muestras de un solo alelo (rojo y gris). (Adaptado de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una v más grande</a>ersión de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figura 4. Mutant amplificación alelo sesgo (MAAB). A. Progresivamente la reducción de la temperatura de recocido de amplificación de la reacción sesgos pico de fusión hacia pico correspondiente al alelo mutante (temperatura más baja) en una muestra polygenomic o polyallelic. B. MAAB resulta en la sensibilidad para detectar HRM menor alelos presentes en menos de 1% en muestras polygenomic o polyallelic. (Parte B adaptado de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Tabla 1. Configuración de alta resolución de las reacciones de amplificación de fusión basada en la sonda. <table><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen por reacción (96 pocillos placa y tubo capilar) </td><td> Volumen por reacción (384 pocillos placa) </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4.5 l </td><td> 2-2,5 l </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x exceso de imprimación </td><td> 1 l </td><td> 0.5 l </td><td> 0,50 M </td></tr><tr><td> 10 x otro cebador </td><td> 1 l </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 M </td></tr><tr><td> 10x Sonda </td><td> 1 l </td><td> 0.5 l </td><td> 0,40 M </td></tr><tr><td> Agua PCR grado </td><td> 2.1 l </td><td> 0.5-1 l </td><td></td></tr><tr><td> El ADN molde </td><td> 1 l </td><td> 0.5 l </td><td> 0,01-10 ng / l </td></tr><tr><td></td><td> 10 l </td><td> 5 l </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Standard alta resolución de las condiciones de amplificación de fusión. <table><tbody><tr><td> La temperatura </td><td> Hora </td></tr><tr><td> Mantener </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 ciclos </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Esta temperatura es dependiente de amplicón Tabla 3. Las condiciones de amplificación para la amplificación alelo mutante sesgo. <table><tbody><tr><td> La temperatura </td><td> Hora </td><td> Ciclos </td><td> Tasa de rampa </td><td> Modo de adquisición </td><td> Modo de análisis </td></tr><tr><td> Desnaturalizar </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Ninguno </td&gt; <td> Ninguno </td></tr><tr><td rowspan="2"> Ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sec </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Ninguno </td><td rowspan="2"> Cuantificación </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Soltero </td></tr><tr><td rowspan="3"> Derretir </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Continua </td><td rowspan="2"> Derretir </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Esta temperatura es amplicón-dependiente y se reducirá cuando se realiza MAAB

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Si bien el análisis alta resolución de fusión ofrece la capacidad de diferenciar entre polimorfismos de nucleótido único en una población heterogénea, alelo mutante sesgo de amplificación puede aumentar su capacidad para detectar alelos presentes en porcentajes relativamente bajos dentro de una muestra. Este protocolo describe las mejoras que mejoran la sensibilidad del análisis de fusión de alta resolución.

Los métodos para aumentar la sensibilidad de alta resolución de fusión polimorfismo de nucleótido único Genotipado de la Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K vistas.  Harvard University.  Si bien el análisis alta resolución de fusión ofrece la capacidad de diferenciar entre polimorfismos de nucleótido único en una población heterogénea, alelo mutante sesgo de amplificación puede aumentar su capacidad para detectar alelos presentes en porcentajes relativamente bajos dentro de una muestra. Este protocolo describe las mejoras que mejoran la sensibilidad del análisis de fusión de alta resolución. 

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Pintura de cromosomas 2D y 3D en mosquitos de la malaria

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...