Este protocolo es una forma muy simple y eficiente de detectar mutantes generados por la tecnología CRISPR / Cas9 de numerosos individuos. Las dos principales ventajas de esta técnica son que se puede realizar en pocas horas y que es aplicable a multitud de organismos. El diseño de imprimación puede ser un desafío para ciertos genes y se pueden requerir múltiples rondas de diseño y verificación de imprimación para que HRMA sea eficiente.
Para realizar una PCR de gradiente, comience por preparar una mezcla maestra. Luego retire 19 microlitros de la mezcla maestra para el control sin plantilla o NTC en una placa de 96 pocillos. A continuación, agregue la plantilla a la mezcla maestra restante.
Alícuota 20 microlitros de la mezcla de muestra en la placa de 96 pocillos. Realizar PCR siguiendo los parámetros de ciclo y luego generar los perfiles de fusión térmica utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito. Después de reunir todo el material requerido, prepare una mezcla maestra con 0,5 microlitros del reactivo de liberación de ADN y 20 microlitros de tampón de dilución por individuo a genotipar.
Usando una pipeta multicanal, alícuota 20 microlitros de la mezcla en una placa de PCR y deje la placa de PCR en hielo. A continuación, coloque los mosquitos G1 anestesiados en una placa de Petri de vidrio para mantenerlos sedados y coloque ocho mosquitos de tipo silvestre en la segunda placa de Petri. Limpie un par de pinzas con etanol al 70% y use las pinzas desinfectadas para eliminar una de las patas traseras de los mosquitos.
Luego, sumerja la pierna en la solución de reactivo de liberación de ADN. Coloque el mosquito en el vial correspondiente y cierre el vial con una esponja. Una vez hecho esto, limpie las pinzas con etanol al 70% antes de proceder a quitar la pata del siguiente mosquito hasta que se complete la placa de 96 pocillos.
Más tarde, selle la placa con un sello de placa de PCR óptica e incube la placa de PCR que contiene las patas a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, seguida de la incubación a 98 grados centígrados durante dos minutos. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente. Para la PCR, prepare una mezcla maestra que contenga los componentes preferidos y luego use una pipeta multicanal para transferir 19 microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
Después de transferir un microlitro de la solución de liberación de ADN que contiene ADN de mosquito previamente preparado a la placa, selle la placa con un sello de placa de PCR óptica. Realice la PCR con los parámetros de ciclo apropiados para generar perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros descritos en el manuscrito, luego examine los perfiles de fusión asignando un control de tipo salvaje al clúster de referencia. Marque los diferentes clústeres con los colores correspondientes en la plantilla de 96 pocillos.
A continuación, seleccione los individuos con curvas de interés y retire los individuos seleccionados de los tubos para cruzar hacia atrás. La alimentación de sangre lo hizo hembras, seguido de la recolección de G2A. En el análisis representativo, se muestra el análisis de secuencia del mutante ZIP11 del Aedes aegypti.
El electroferograma de los mutantes heterocigotos Aedes aegypti ZIP11 indicó la posición del nucleótido donde se produjo el indel. El indel está representado por un cambio de picos simples a dobles, ya que las posiciones polimórficas muestran ambos nucleótidos concomitantemente. Al final de la ejecución, el número de pares de bases eliminados o insertados se calculó contando los picos individuales.
Los mosquitos que contienen mutaciones en los genes Aedes aegypti ZIP11 y myo-fem fueron genotipados y secuenciados verificados utilizando el análisis de fusión de alta resolución de HRMA. Las señales fluorescentes de las muestras se normalizaron a valores relativos de uno a cero. Además, cada curva se restó de la referencia de tipo salvaje y denotó el aumento correspondiente.
En los resultados representativos se muestra una asignación automática de clúster fallida, donde no se hizo una distinción adecuada entre los grupos. Además, cada muestra se analizó individualmente y se asignó a los grupos correctos en función de la similitud con las muestras de referencia de heterocigotos, homocigotos y transheterocigotos. Después de realizar HRMA, es necesario secuenciar el ADN de los individuos mutados para analizar los indels e identificar las otras mutaciones en la secuencia objetivo.
