Una de las principales ventajas de esta técnica para caracterizar los transportadores de membrana es que se puede determinar la afinidad relativa del transportador para sustratos específicos, así como obtener información sobre el mecanismo de transporte. La caracterización de las proteínas de membrana que utilizan gradientes proteicos para impulsar el transporte del sustrato es particularmente adecuada para este ensayo de vesículas de adentro hacia afuera que demostramos aquí. Si bien este ensayo requiere algunos equipos especializados, como una prensa francesa y acceso a una ultracentrífuga, creemos que puede ser técnicamente más fácil que los ensayos que requieren que los transportadores de membranas se reconstituyen en liposomas artificiales.
La principal ventaja de esta técnica es que nos permite cuantificar las afines relativas para diferentes sustratos y realizar ensayos de competición para probar el efecto de los sustratos competidores en las rejillas de transporte. En el caso del transportador BAT1 utilizado para ilustrar este ensayo, también pudimos mostrar la activación del sustrato del transportador por arginina. Para comenzar este procedimiento, cultiva las células mutantes E.coli preparadas que expresan la proteína diana inoculando una sola colonia en cinco mililitros de poliamina 3 medios con antibióticos apropiados y creciendo durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, transferir este cultivo a 500 mililitros de poliamina fresca 3 medios que se complementa con 0.0002%arabinose y crecer hasta que el cultivo celular alcanza un OD600 de entre 0.6 y 0.8. Después de esto, centrifugar a 2000 veces G y a cuatro grados Celsius durante 15 minutos para recoger el pellet celular. Vuelva a suspender el pellet y lávelo tres veces con el tampón uno centrifugando a 2000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos cada vez.
El volumen final de celdas en el búfer uno después del tercer giro debe ser de 10 mililitros. Establecer una célula de presión francesa de 35 mililitros y verter la suspensión celular en el cuerpo de la célula. Encienda la máquina con el interruptor en el RHS en la parte posterior de la unidad y ajuste el selector de relación a alto.
Encienda el interruptor de la bomba. El pistón comenzará a subir desde la base para desplazar el aire en la cámara. Aumente la presión girando la válvula de aumento de presión en el sentido de las agujas del reloj hasta que el medidor alcance 640 PSI.
Esto creará una presión interna de 10.000 PSI. Una vez que la celda haya alcanzado la presión objetivo, abra ligeramente el conjunto de la válvula de flujo girándola en sentido contrario a las agujas del reloj. Ajuste la apertura de la válvula para permitir un caudal de solo 10 gotas por minuto.
Cuando la línea de tope en el cuerpo del pistón alcanza la parte superior de la celda de flujo, la bomba se apaga. Baje la placa inferior colocando el selector de relación hacia abajo y, a continuación, activando el interruptor de la bomba. Cuando la placa inferior esté completamente retraída, reduzca la presión del sistema a cero girando la válvula de aumento de presión completamente en sentido contrario a las agujas del reloj.
Apague el interruptor de la bomba y apague la máquina. Centrifugar el eluant de prensa francés a 10.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos para eliminar las células ininterrumpidas y los desechos celulares. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga.
Ultracentrífaza el sobrenadante resultante a 150.000 veces G y a cuatro grados Celsius durante una hora para peletizar las vesículas de membrana. Lave las vesículas de membrana una vez sin volver a suspendido en el tampón dos. Luego, utilice una amoladora de tejido Dounce para volver a suspender las vesículas de membrana en el búfer dos.
Preparar 100 microlitros alícuotas de los preparados de membrana en tubos centrífugos de 1,5 mililitros y almacenarlos en menos 80 Grados Centígrados. En primer lugar, lavar y volver a suspender las vesículas en 30 mililitros de Tris a pH 7,8, que contiene 0,1 milivola de cloruro de cobalto II. Agregue un microlitro de carboxepepeposa A en cloruro de sodio, Tris y cloruro de cobalto II a cada muestra de 100 microlitros.
Incubar a 20 grados centígrados durante 20 minutos. Añadir cinco microlitros de una solución que contenga EDTA sódico y 2-Mercaptoetanol a PH 7.5 para detener la digestión. Incubar la solución a temperatura ambiente durante una hora para inactivar completamente la enzima.
A continuación, añadir entre cinco y 10 microlitros de una solución que contenga dodecil sulfato de litio, glicerol, azul bromopol y Tris a pH 7,5 a 100 microlitros de la muestra y analizar muestras por electroforesis. Para realizar una hinchazón amino, ponga un filtro de nitrocelulosa humedecido con fosfato de hidrógeno sódico de 25 milimolar sobre el gel de poliacrilamida. Colóquelos entre dos filtros de celulosa humedecidos y, finalmente, entre dos almohadillas de plástico humedecido.
Coloque este conjunto entre los electrodos de una cámara que contenga 25 mililitros de fosfato de hidrógeno sódico milimolar a una temperatura de entre dos y cuatro grados centígrados. Electrotransferar las proteínas a 20 voltios y a dos o tres amperios durante tres horas. Bloquee la membrana de nitrocelulosa en el tampón de bloqueo durante la noche a dos grados centígrados.
Al día siguiente, incubar la nitrocelulosa a 20 mililitros de uno a 5.000 dilución de anticuerpos anti-su C-terminal HRP y tampón de bloqueo durante dos horas y lavar dos veces con 50 mililitros de tampón durante un total de 60 minutos. Para visualizar la mancha amino, disolver seis miligramos de 4-cloro-1-naftol en 20 mililitros de alcohol desnaturalado y añadir 80 mililitros de 15 tris mililolares y 50 microlitros de 30%peróxido de hidrógeno. Bañe el papel de filtro en esta solución de sustrato durante 20 minutos.
Cuando se haya desarrollado suficiente color, enjuague la membrana con agua y deje que se seque. Para empezar, incubar la alícuota de 100 microlitros de vesículas de membrana a 12 grados centígrados durante cinco minutos. Añadir el tampón 3 que contenga poliaminas radiomarcadas a una concentración final de 50 micromolares a las vesículas de membrana en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para iniciar el transporte.
Lleve a cabo el ensayo de transporte a 12 grados centígrados durante un minuto. Después de esto, transfiera las mezclas de reacción al colector de filtración y filtre a través de un filtro de membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros. Añadir tres mililitros de tampón de ensayo helado que contenga una concentración diez veces mayor de poliaminas sin etiquetar, seguidos de tres mililitros de tampón de ensayo sin las poliaminas para reducir la unión no específica.
Transfiera los filtros lavados a viales de centelleo desechables de 20 mililitros que contengan 10 mililitros de líquido de centelleo, y utilice un contador de centelleo líquido para determinar la radiactividad. Calcule la absorción neta de poliamina como se describe en el protocolo de texto. Determinar el Km para el sustrato midiendo la absorción de sustrato radiomarcado en vesículas expresando la proteína diana y calcular la cinética Michaelis-Menten utilizando un método de regresión no lineal.
Para los experimentos de competición, añada el sustrato competitivo no etiquetado fabricado en el tampón de ensayo al tubo centrífugo que contiene 100 microlitros de vesículas a 12 grados centígrados y, al mismo tiempo, añada 50 micromolares de la poliamina radiomarcada. Mida la radiactividad atrapada dentro de las vesículas como se describió anteriormente. Determinar un KM padre para los sustratos competitivos midiendo la absorción de poliaminas radiomarcadas y la presencia de 100 sustratos micromolares o no etiquetados superiores y utilizar un método de regresión no lineal para trazar la curva.
En este estudio, un anti-portero se caracteriza por expresar primero la proteína en E.coli, y luego, generar vesículas de membrana para que la proteína expresada heterólogamente pueda ser ensayada en un sistema libre de células. Una mancha occidental se utiliza para verificar que AtBAT1 se translota a vesícula. El sondeo de la mancha con un anticuerpo C-terminal anti-su revelación de una proteína de construcción de fusión que es aproximadamente 72,3 kilodaltons.
La digestión de las vesículas antes de SDS-PAGE dio lugar a una disminución, pero no una pérdida completa de la señal de la sonda. A 12 grados Celsius, la captación de una espermicida radiomarcada por las vesículas es más alta en un minuto y permaneció lineal durante tres minutos. Por lo tanto, el tiempo de incubación para el ensayo de transporte se fija en un minuto.
Después de un minuto, no hay absorción neta de isótopos por vesículas de membrana que fueron preparadas y almacenadas a pH 8.0, ya que no hay gradiente de protones a través de la membrana vesícula. Para demostrar el efecto de la disipación del gradiente de protones artificiales, las vesículas de membrana se incuban en pH 8.0 tampón durante 10 minutos antes de la adición del sustrato etiquetado, lo que conduce a una absorción mínima del sustrato radiomarcado. En conjunto, estos resultados indican que la absorción de espermatozoides impulsada por protones se debe a la proteína BAT1.
Para determinar la especificidad del sustrato de la proteína, los valores de Km se calculan midiendo la absorción del sustrato radiomarcado en diferentes concentraciones. Los valores de Km para espermidina, putresina, y arginina indican que esta proteína es un intercambiador de poliamina y arginina de alta afinidad. La afinidad del transportador para un sustrato en particular también se puede determinar indirectamente mediante el uso de ensayos de competencia.
Estos ensayos revelan que GABA es un inhibidor competitivo de la espermilina. Además, la medición de la absorción de 50 micromolares de espermidina radiomarcada en presencia de concentraciones variables de diferentes aminoácidos revela que AtBAT1 también es capaz de transportar glutamato y alanina a concentraciones milimolares. Al realizar este procedimiento, la integración del transportador de membrana en la membrana bacteriana es, obviamente, crítica.
La verificación de que la proteína de interés está integrada en la membrana se puede hacer utilizando anticuerpos dirigidos contra las etiquetas C-terminal. La variación genética de los transportadores humanos puede afectar al transporte de metabolitos y fármacos que son sustratos del transportador en particular. Por lo tanto, la variación alélica puede afectar, tanto, la absorción y la excreción de drogas.
Muchas variantes alélicas pueden ser rápidamente hechas por mutagénesis dirigida lateralmente del gen transportador en un vector de expresión. Los ensayos funcionales de estas variantes se pueden probar en condiciones muy controladas utilizando ensayos de vesículas de adentro hacia afuera. Los transportadores de membrana constituyen de ocho a 10 de todas las proteínas y la mayoría no se han caracterizado completamente en ninguno de los organismos modelo.
Los transportadores que están localizados en las membranas de los orgánulos son particularmente difíciles de caracterizar por la expresión heteróloga en las células eucariotas. Si los transportadores de tipo de intercambio o mediados por protones se pueden localizar a esta membrana de E.coli, estos transportadores pueden caracterizarse funcionalmente utilizando este ensayo in vitro. La calidad y el rendimiento de las vesículas se ve afectada por la tasa de elución de fragmentos celulares de la prensa francesa.
Al realizar ensayos de transporte de vesículas con isótopos, es importante tener una configuración experimental que facilite la realización de réplicas experimentales. Hay muchas maneras de hacer esto, pero creemos que será útil para nosotros mostrarle cómo lo hemos hecho.
