Nuestro protocolo describe un método para crear un modelo de RA. Su tasa de éxito es superior al 93 por ciento y su patogénesis depende de las células T, las células B y la inmunidad innata, lo que permite a los investigadores estudiar mejor la patogénesis de la AR desde una perspectiva inmune global. Luego utilizamos células INKT con efectos inmunomoduladores para su tratamiento.
Las células INKT tienen un buen efecto en el tratamiento mediante la introducción in vivo que proporcionan soporte de datos básicos para la aplicación clínica de células INKT y realmente explotan el valor de aplicación clínica de las células INKT. La mayor ventaja de esta tecnología es que es fácil de operar y fácil de copiar. Demostrando el procedimiento serán Chen Shengde, Gao Xiang y Zhang Jingnan, estudiante graduado de mi laboratorio.
Para empezar, pesa 1,75 miligramos de fragmentos HGPI325 a 339 y HGPI469 a 483 y disuelve en 5,25 mililitros de 4 grados centígrados de agua triple destilada. Disolver el adyuvante completo de Freund en un baño de agua Celsius de 50 grados. Dibuje 5,25 mililitros en otro tubo centrífugo de 10 mililitros y enfríelo para su uso.
Coloque la mezcla de la solución HG6PI y la solución adyuvante de Complete Freund en una unidad de emulsión artificial con dos jeringas de vidrio conectadas. En un baño de hielo, empuje la jeringa a una velocidad y frecuencia constantes de diez a veinte veces por minuto para emulsionar completamente la solución de péptido de mezcla y completar la solución adyuvante de Freund. Luego, mantenga las gotas de emulsión en el agua durante diez minutos.
A continuación, inyectar 150 microlitros de los HG6BP emulsionados en la raíz de la cola del ratón por vía subcutánea. Inmediatamente y después de 48 horas, inyectar 200 miligramos de toxina tos ferina en el ratón por vía intraperineal. Ahora, inyectar ratón DBA1 normal por vía intraperineal sin el gausser en la dosis de 0.1 miligramos por kilogramo de peso corporal.
Tres días después del modelado, después de la anestesia, aísle el bazo del ratón. Preparar una suspensión de una sola célula cortando y moliendo el bazo en un tamiz de malla 200. Lave la suspensión celular con PBS.
Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Re suspenda las células con un mililitro de solución de tejido sanguíneo entero. Añadir tres mililitros de medio de separación de linfocitos de ratón.
Y luego centrifugar las células durante 20 minutos a 300 veces g a temperatura ambiente. Para purificar las células INKT, resuspendir 10 a las células séptimas con 100 microlitros de cuatro grados Celsius PBS, añadir 10 microlitros de gasa alfa cargado CD1 tetramer PE e incubarlos a 4 grados Celsius durante quince minutos en la oscuridad. Lavar las células dos veces con PBS y resuspenderlas en 80 microlitros de PBS.
Añadir 20 microlitros de microperlas anti-PE e incubarlos a cuatro grados centígrados durante veinte minutos en la oscuridad. Lávelos dos veces con PBS y resuspender las células con 500 microlitros de PBS. Coloque la columna de clasificación en el campo magnético del clasificador MACS y enjuague con 500 microlitros de PBS.
Agregue la suspensión de celda preparada a la columna de clasificación, recoja el flujo y enjuague tres veces con el búfer PBS. Quite el campo magnético y agregue un mililitro de búfer PBS a la columna de clasificación. Empuje rápidamente el émbolo a una presión constante para introducir las células etiquetadas en el tubo de recogida.
Y obtener las células purificadas inKT. Cuente con un contador de celdas automatizado. Para identificar el fenotipo celular INKT, primero, tome una vez diez a las sextas células de las células PURIFICAdas de INKT y resusppend en 50 microlitros de PBS.
Agregue 0,5 microlitros de tetrámero alpha gausser PE CD1, o 10 microlitros de FITC TCR beta en el tubo de control positivo único. Añadir 0,5 microlitros de tetrámero alpha gausser PE CD1, Añadir 10 microlitros de FITC TCR beta en el tubo de muestra. Incubarlos a cuatro grados centígrados durante treinta minutos en la oscuridad.
Después de eso, lavar las células en PBS y luego centrífuga a 200 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de solución de trabajo de permeabilización de fijación FoxP3. Y incubar las células durante 45 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
A continuación, agregue un mililitro de 1x solución de trabajo de permeabilización y centrifugar las células a 500 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Añadir un microlitro de AlexaFluor 647 ratón anti-PLZF y un microlitro de PerCP Cy5.5 ratón anti-Tbet e incubar durante treinta minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, añada dos microlitros de solución de trabajo de tampón de permeabilización y centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos para su limpieza. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 500 microlitros de PBS y medir por citometría de flujo.
En este estudio, en comparación con el grupo de control, los dedos del grupo modelo RA comenzaron a mostrar hinchazón roja después de modelar con agravamiento gradual. A los 14 días, la hinchazón roja en la articulación del tobillo alcanzó su punto máximo seguido de un alivio gradual. Los resultados patológicos muestran que el grado de infiltración de las células inflamatorias en el tejido sinovial del tobillo de los ratones modelo RA fue diferente en diferentes etapas.
La inflamación máxima se produjo en el día 14 después del modelado. En el grupo modelo de RA, los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias aumentaron significativamente 11 días y 14 días después del modelado. Mientras que las citoquinas antiinflamatorias disminuyeron significativamente.
Esta cifra muestra que la tasa de INKT2 en ratones normales fue de alrededor del cinco por ciento. La tasa de INK2 fue de aproximadamente el 82 por ciento después de la inducción in vivo. La tasa de INK2 fue más del 92 por ciento después de la purificación del MACS.
Aquí mostramos un método para emulsionar el polipéptido principal que vemos en RA. Las gotas emulsionadas se mantienen en el agua durante 10 minutos. Los resultados se están dispersando. Este protocolo es un nuevo complemento para el tratamiento de células NKT especiales elevadas por RA.
Que se puede aplicar hacia la inmunoterapia celular u otras enfermedades autoinmunes y tumores. Este modelo puede estimular la proliferación general de células T CD4 y déficits de células NKT en pacientes con AR, lo que sienta las bases para un estudio en profundidad de las vías inmunitarias de la AR. En este protocolo, la toxina de la tos ferina se inyecta interperitonealmente durante el modelado.
Por favor, use ropa experimental y guantes desechables. Y llevar todas las normas de funcionamiento con el fin de evitar la puñalada una infección.
