Наш протокол описывает метод построения модели RA. Его уровень успеха составляет более 93 процентов и его патогенез зависит от Т-клеток, В-клеток и врожденного иммунитета, что позволяет исследователям лучше изучать патогенез РА с глобальной иммунной точки зрения. Затем мы используем клетки INKT с иммуномодулирующих эффектов для их лечения.
Клетки INKT оказывают хорошее влияние на лечение путем внедрения in vivo, которые обеспечивают базовую поддержку данных для клинического применения клеток INKT и действительно взрывает клиническую ценность применения клеток INKT. Наибольшее преимущество этой технологии заключается в том, что она проста в эксплуатации и проста в копировании. Демонстрация процедуры будет Чэнь Шингде, Гао Сян, и Чжан Цзиннань, аспирант из моей лаборатории.
Для начала взвесите 1,75 миллиграмма HGPI325 до 339 и HGPI469 до 483 фрагментов и растворите их в 5,25 миллилитров 4 градусов по Цельсию тройной дистиллированной воды. Растворите Адъювант Полного Фрейнда в водяной бане 50 градусов по Цельсию. Нарисуйте 5,25 миллилитров в другую 10 миллилитровую центрифугу и охладите ее для использования.
Поместите смесь раствора HG6PI и адъювантного раствора Complete Freund в искусственный блок эмульгации с двумя стеклянными шприцами, соединенными. В ледяной ванне, нажмите шприц на постоянной скорости и частоте от десяти до двадцати раз в минуту, чтобы полностью эмульгировать раствор пептида смеси и завершить Адъювантный раствор Фрейнд. Затем держите капли эмульсии в воде в течение десяти минут.
Затем ввипппе 150 микролитров эмульгифицированных HG6PIs в хвостовой корень мыши подкожно. Немедленно и после 48 часов, ввиснуть 200 миллиграммов токсина коклюша в мышь внутриперинально. Теперь, вводить нормальные DBA1 мыши внутриперинально без гауссера в дозировке 0,1 миллиграмма на килограмм массы тела.
Через три дня после моделирования, после анестезии, изолировать селезенку мыши. Подготовьте одноклеточную подвеску путем разрезания и измельчения селезенки в сито сетки 200. Вымойте подвеску клетки с помощью PBS.
Центрифуга по 200 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Повторно приостанавливать клетки с одним миллилитром раствора цельной ткани крови. Добавьте три миллилитров мышиной среды разделения лимфоцитов.
А затем центрифугировать клетки в течение 20 минут при 300 раз г при комнатной температуре. Для очистки клеток INKT, resuspend 10 до седьмой клетки с 100 микролитров четырех градусов по Цельсию PBS, добавить 10 микролитр альфа-гауссер загружен CD1 тетрамер PE и инкубировать их при 4 градусах по Цельсию в течение пятнадцати минут в темноте. Вымойте клетки дважды с PBS и повторно использовать их в 80 микролитров PBS.
Добавьте 20 микролитров анти-PE микробусов и инкубировать их при четырех градусах по Цельсию в течение двадцати минут в темноте. Вымойте их дважды с PBS и повторного перерасхода клеток с 500 микролитров PBS. Поместите сортированную колонку в магнитное поле сортера MACS и смойте 500 микролитров PBS.
Добавьте подготовленную подвеску ячейки в столбец сортировки, соберите поток и трижды прополощите буфером PBS. Удалите магнитное поле и добавьте один миллилитр буфера PBS в столбец сортировки. Быстро нажмите поршень при постоянном давлении, чтобы загнать помеченные клетки в трубку сбора.
И получить очищенные клетки INKT. Считайте с помощью автоматизированного счетчика ячеек. Для идентификации фенотипа клеток INKT, во-первых, возьмите один раз десять-шестой клетки из очищенных клеток INKT и повторно напечатать их в 50 микролитров PBS.
Добавьте 0,5 микролитров тетрамера alpha gausser PE CD1, или 10 микролитров бета-версии FITC TCR в единую положительную контрольную трубку. Добавьте 0,5 микролитров тетрамера alpha gausser PE CD1, добавьте в образец трубки 10 микролитров бета-версии FITC TCR. Инкубировать их при четырех градусах по Цельсию в течение тридцати минут в темноте.
После этого, мыть клетки в PBS, а затем центрифуги в 200 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте один миллилитр пермяки фиксации FoxP3 рабочего решения. И инкубировать клетки в течение 45 минут при четырех градусах по Цельсию в темноте.
Затем добавьте один миллилитр 1x пермеабилизации рабочего раствора и центрифуг клетки при 500 раз g при комнатной температуре в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта. Добавьте один микролитер AlexaFluor 647 мыши анти-PL'F и один микролитер PerCP Cy5.5 мыши анти-Tbet и инкубировать в течение тридцати минут при комнатной температуре в темноте.
Далее добавьте два микролитров пермяка буферного рабочего раствора и центрифугу при 200 раз г в течение пяти минут для очистки. Откажитесь от супернатанта. Повторное распределение клеток в 500 микролитров PBS и измерения по потоку цитометрии.
В этом исследовании, по сравнению с контрольной группой, такие темы модельной группы РА начали показывать красный отек после моделирования с постепенным обострением. В 14 дней, красный отек в голеностопного сустава достиг пика следуют постепенное облегчение. Патологические результаты показывают, что степень инфильтрации воспалительных клеток в голеностопной синовиальной ткани мышей модели РА была разной на разных стадиях.
Пик воспаления произошел на 14-й день после моделирования. В модельной группе РА уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови значительно повысился через 11 дней и 14 дней после моделирования. При этом противовоспалительные цитокины значительно уменьшились.
Этот показатель показывает, что скорость INKT2 у нормальных мышей составила около пяти процентов. Скорость INK2 составила около 82 процентов после индукции in vivo. После очистки MACS скорость INK2 составила более 92 процентов.
Здесь мы показываем метод эмульгировать основные полипептид мы видим в РА. Эмульгифицированные капли хранятся в воде в течение 10 минут. Результаты рассеивания. Этот протокол является новым дополнением для лечения РА поднятые специальные клетки NKT.
Которые могут быть применены к клеточной иммунотерапии или других аутоиммунных заболеваний и опухолей. Эта модель может стимулировать общее распространение CD4 Т-клеток и NKT-клеток дефицита у пациентов РА, который закладывает основу для углубленного изучения РА иммунных путей. В этом протоколе, коклюш токсин вводится интерперитонеально во время моделирования.
Пожалуйста, носите экспериментальную одежду и одноразовые перчатки. И нести все стандарты работы, с тем чтобы предотвратить ножевое ранение инфекции.
