Unser Protokoll beschreibt eine Methode zum Erstellen eines RA-Modells. Seine Erfolgsrate liegt bei über 93 Prozent und seine Pathogenese hängt von T-Zellen, B-Zellen und angeborener Immunität ab, was es Forschern ermöglicht, die Pathogenese von RA aus einer globalen Immunperspektive besser zu untersuchen. Dann verwenden wir INKT-Zellen mit immunmodulatorischen Wirkungen für ihre Behandlung.
INKT-Zellen haben eine gute Wirkung auf die Behandlung durch in vivo Einführung, die grundlegende Datenunterstützung für die klinische Anwendung von INKT-Zellen bieten und den klinischen Anwendungswert von INKT-Zellen wirklich explodieren lassen. Der größte Vorteil dieser Technologie ist, dass sie einfach zu bedienen und einfach zu kopieren ist. Demonstriert wird das Verfahren von Chen Shengde, Gao Xiang und Zhang Jingnan, Doktoranden meines Labors.
Zunächst wiegen 1,75 Milligramm HGPI325 bis 339 und HGPI469 bis 483 Fragmente und lösen sie in 5,25 Milliliter n.G. 4 Grad Celsius dreifach destilliertem Wasser auf. Lösen Sie Complete Freund es Adjuvant in einem 50 Grad Celsius Wasserbad auf. 5,25 Milliliter in ein weiteres 10 Milliliter Zentrifugenrohr ziehen und für den Einsatz abkühlen lassen.
Setzen Sie die Mischung aus HG6PI-Lösung und Complete Freunds Adjuvant-Lösung in eine künstliche Emulgierungseinheit mit zwei Glasspritzen, verbunden. In einem Eisbad die Spritze mit einer konstanten Geschwindigkeit und Frequenz von zehn bis zwanzig Mal pro Minute schieben, um die MischungPeptidlösung vollständig zu emulgieren und Freunds Adjuvante-Lösung zu vervollständigen. Dann die Emulsionströpfchen zehn Minuten im Wasser aufbewahren.
Als nächstes injizieren Sie 150 Mikroliter der emulgierten HG6PIs subkutan in die Schwanzwurzel der Maus. Sofort und nach 48 Stunden 200 Milligramm Pertussistoxin in die Maus intraperinieren. Nun, injizieren normale DBA1 Maus intraperinal ohne den Gauß in der Dosierung von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht.
Drei Tage nach dem Modellieren, nach der Anästhesisierung, isolieren Sie die Milz der Maus. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor, indem Sie die Milz in einem 200-Mesh-Sieb schneiden und schleifen. Waschen Sie die Zellsuspension mit PBS.
Zentrifugieren Sie bei 200 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen mit einem Milliliter Vollblutgewebelösung aus. Fügen Sie drei Milliliter Maus Lymphozyten-Trennmedium.
Und dann zentrifugieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei 300 mal g bei Raumtemperatur. Um die INKT-Zellen zu reinigen, setzen Sie 10 auf die siebten Zellen mit 100 Mikrolitern von vier Grad Celsius PBS, fügen Sie 10 Mikroliter Alpha-Gauß geladen CD1 Tetramer PE und inkubieren sie bei 4 Grad Celsius für fünfzehn Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und setzen Sie sie in 80 Mikroliter PBS wieder aus.
Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-PE-Mikroperlen hinzu und bebrüten sie bei vier Grad Celsius für zwanzig Minuten im Dunkeln. Waschen Sie sie zweimal mit PBS und suspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikroliter PBS. Legen Sie die Sortiersäule in das Magnetfeld des MACS-Sortierers und spülen Sie sie mit 500 Mikroliter PBS.
Fügen Sie die vorbereitete Zellsuspension zur Sortierspalte hinzu, sammeln Sie den Durchfluss und spülen Sie sie dreimal mit dem PBS-Puffer. Entfernen Sie das Magnetfeld, und fügen Sie der Sortierspalte einen Milliliter PBS-Puffer hinzu. Drücken Sie den Kolben schnell mit konstantem Druck, um die beschrifteten Zellen in das Sammelrohr zu treiben.
Und erhalten Sie die gereinigten INKT-Zellen. Zählen Sie mit einem automatisierten Zellenzähler. Um den INKT-Zellphänotyp zu identifizieren, nehmen Sie zunächst ein mal zehn bis sechs Zellen aus den gereinigten INKT-Zellen und suspendieren sie in 50 Mikroliter PBS.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter Alpha-Gauß PE-CD1-Tetramer oder 10 Mikroliter FITC TCR beta in die einzelne Positivkontrollröhre. Fügen Sie 0,5 Mikroliter Alpha-Gauß PE-CD1-Tetramer hinzu, fügen Sie 10 Mikroliter FITC TCR Beta in das Probenröhrchen. Bebrüte sie bei vier Grad Celsius für dreißig Minuten im Dunkeln.
Danach die Zellen in PBS waschen und dann fünf Minuten lang bei 200 mal g zentrieren. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter FoxP3 Fixationspermeabilisationslösung hinzu. Und die Zellen 45 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln bebrüten.
Dann fügen Sie einen Milliliter 1x 1x Permeabilisation Arbeitslösung und Zentrifugieren sie die Zellen bei 500 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie einen Mikroliter AlexaFluor 647 Maus Anti-PLZF und einen Mikroliter PerCP Cy5.5 Maus Anti-Tbet und inkubieren für dreißig Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter Permeabilisationspuffer Arbeitslösung und Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten für die Reinigung. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS aus und messen Sie die Durchflusszytometrie.
In dieser Studie, verglichen mit der Kontrollgruppe, begannen die Zehen der RA-Modellgruppe nach der Modellierung mit allmählicher Verschlimmerung rote Schwellungen zu zeigen. Nach 14 Tagen erreichte die rote Schwellung im Sprunggelenk ihren Höhepunkt, gefolgt von einer allmählichen Linderung. Die pathologischen Ergebnisse zeigen, dass der Infiltrationsgrad von Entzündungszellen im Knöchelsynovialgewebe der RA-Modellmäuse in verschiedenen Stadien unterschiedlich war.
Spitzenentzündung trat am Tag 14 nach der Modellierung auf. In der RA-Modellgruppe stiegen die Serumspiegel der proinflammatorischen Zytokine 11 Tage und 14 Tage nach der Modellierung signifikant an. Während entzündungshemmende Zytokine deutlich verringert.
Diese Zahl zeigt, dass die INKT2-Rate bei normalen Mäusen bei etwa fünf Prozent lag. Die INK2-Rate lag nach In-vivo-Induktion bei etwa 82 Prozent. Die RATE von INK2 lag nach DER MACS-Reinigung bei über 92 Prozent.
Hier zeigen wir eine Methode, um das hauptpolypeptid zu emulgieren, das wir in RA sehen. Die emulgierten Tröpfchen werden 10 Minuten im Wasser aufbewahrt. Die Ergebnisse sind dispergierend. Dieses Protokoll ist ein neues Add-on für die Behandlung von RA-erhöhten speziellen NKT-Zellen.
Die auf Zellimmuntherapie oder andere Autoimmunerkrankungen und Tumoren angewendet werden können. Dieses Modell kann die Gesamtproliferation von CD4-T-Zellen und NKT-Zellen bei RA-Patienten stimulieren, was die Grundlage für eine eingehende Untersuchung der RA-Immunbahnen legt. In diesem Protokoll wird Pertussistoxin während der Modellierung interperitonal injiziert.
Bitte tragen Sie experimentelle Kleidung und Einweghandschuhe. Und tragen Sie alle Standards der Operation, um Stichwunde eine Infektion zu verhindern.
