당사의 프로토콜은 RA 모델을 빌드하는 방법을 설명합니다. 그것의 성공률은 93% 이상이고 그것의 병인은 T 세포, B 세포 및 선천적인 면역에 달려 있습니다, 연구원은 글로벌 면역 관점에서 RA의 병인을 더 잘 연구할 수 있습니다. 그런 다음 우리는 그들의 처리를 위한 면역 조절 효력을 가진 INKT 세포를 이용합니다.
INKT 세포는 INKT 세포의 임상 적용을 위한 기본 데이터 지원을 제공하고 INKT 세포의 임상 적용 가치를 진정으로 폭발시키는 생체 내 도입에 의한 치료에 좋은 영향을 미칩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 조작이 간단하고 복사하기 쉽다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 첸 성데, 가오 샹, 그리고 장징난, 내 실험실에서 대학원생이 될 것입니다.
시작하려면 HGPI325에서 339까지의 1.75 밀리그램과 HGPI469에서 483개의 조각으로 계량하여 섭씨 4도의 5.25 밀리리터에서 용해합니다. 섭씨 50도의 수조에 완전한 Freund의 보조를 녹입니다. 5.25 밀리리터를 또 다른 10 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 식힙니다.
HG6PI 솔루션과 완전한 Freund의 보조 용액을 두 개의 유리 주사기가 연결된 인공 유화제 장치에 넣습니다. 얼음 욕조에서 주사기를 분당 10~20배 일정한 속도로 밀어 혼합물 펩티드 용액을 완전히 유화하고 Freund의 보조 용액을 완성하십시오. 그런 다음 에멀젼 액적을 물에 10분 동안 보관하십시오.
다음으로, 마우스의 꼬리 뿌리에 유화 된 HG6PI의 150 마이크로 리터를 피하로 주입하십시오. 즉시 48 시간 후에 200 밀리그램의 등일성 독소를 마우스 내시간에 주입하십시오. 지금, 체중의 킬로그램 당 0.1 밀리그램의 복용량에서 가저없이 일반 DBA1 마우스 를 내세로 주입.
모델링 후 3일 후, 마취 후 마우스의 비장을 분리합니다. 200 메쉬 체로 비장을 절단하고 분쇄하여 단일 셀 서스펜션을 준비합니다. PBS로 셀 서스펜션을 세척합니다.
원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서 상체를 폐기하십시오. 다시 전체 혈액 조직 용액의 1 밀리 리터와 세포를 일시 중단. 마우스 림프구 분리 배지의 3 밀리리터를 추가합니다.
그리고 실온에서 300배 g에서 20분 동안 세포를 원심분리합니다. INKT 세포를 정화하려면 섭씨 4도의 100 마이크로리터로 7번째 세포에 10을 재중단하고, 10 마이크로리터의 알파 가우저 로드 CD1 테트라머 PE를 추가하고 어둠 속에서 15분 동안 섭씨 4도에서 배양한다. PBS로 세포를 두 번 씻고 PBS의 80 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.
안티 PE 마이크로비드 20 마이크로 리터를 추가하고 어둠 속에서 20 분 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. PBS로 두 번 씻고 PBS의 500 마이크로 리터로 세포를 다시 중단하십시오. 선별 컬럼을 MACS 선별기의 자기장에 놓고 PBS의 500 마이크로리터로 헹구는 다.
준비된 셀 서스펜션을 정렬 열에 추가하고, 흐름을 수집하고, PBS 버퍼로 세 번 헹구는다. 자기장을 제거하고 분류 열에 PBS 버퍼 1 밀리리터를 추가합니다. 플런저를 일정한 압력으로 빠르게 밀어 서 표지된 셀을 수집 튜브로 유도합니다.
정제된 INKT 세포를 얻을 수 있습니다. 자동화된 셀 카운터로 계산합니다. INKT 세포 표현형을 식별하기 위해 먼저 정제된 INKT 세포로부터 10~6세포를 10회 복용하여 PBS의 50마이크로리터로 재보선한다.
알파 가우저 PE CD1 테트라머의 0.5 마이크로리터, 또는 단일 양성 제어 튜브에 FITC TCR 베타의 10 마이크로리터를 추가합니다. 알파 가우저 PE CD1 테트라머의 0.5 마이크로리터를 추가하고 샘플 튜브에 FITC TCR 베타 10 마이크로리터를 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오.
그 후, PBS에서 세포를 씻은 다음 원심 분리기를 5 분 동안 200 배 g로 씻으신다. 상체를 폐기하고 FoxP3 고정 투과화 작업 솔루션의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 그리고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 45 분 동안 세포를 배양하십시오.
그런 다음 1x permeabilization 작업 용액의 1 밀리리터를 추가하고 실온에서 500 배 g에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다. 알렉사플루어 647 마우스 안티 PLZF의 마이크로리터 1개와 PerCP Cy5.5 마우스 안티-트벳의 마이크로리터 1개를 추가하고 어둠 속의 실온에서 30분 동안 배양한다.
다음으로, 충류 완충액 작업 용액 2마이크로리터와 원심분리기를 200배 g에 추가하여 청소를 위해 5분간 추가합니다. 상부체를 폐기합니다. PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 혈류 세포 측정에 의해 측정.
이 연구에서는 대조군과 비교하여 RA 모델 그룹의 발가락이 점진적인 악화로 모델링한 후 빨간색 부종을 보이기 시작했습니다. 14일, 발목 관절의 붉은 부종은 점진적인 완화에 이어 절정에 달했습니다. 병리학적 결과는 RA 모델 마우스의 발목 모연 조직에서 염증 세포의 침투 정도가 다른 단계에서 달랐다는 것을 보여줍니다.
피크 염증은 14일째 포스트 모델링에서 발생했습니다. RA 모델 그룹에서, 프로 염증 성 사이토카인의 혈청 수준은 모델링 후 11 일 및 14 일 크게 증가하였다. 항 염증 사이토 카인은 크게 감소 하는 동안.
이 수치는 정상 마우스에서 INKT2의 비율이 약 5%였다는 것을 보여줍니다. INK2의 비율은 생체 유도 에서 약 82 %였다. INK2의 비율은 MACS 정화 후 92 % 이상이었다.
여기서 우리는 RA에서 볼 수있는 주요 폴리 펩티드를 유화하는 방법을 보여줍니다. 유화 된 물방울은 10 분 동안 물에 보관됩니다. 결과가 분산됩니다. 이 프로토콜은 RA 제기 특수 NKT 세포의 치료를위한 새로운 추가 기능입니다.
이는 세포 면역 요법 또는 기타 자가 면역 질환 및 종양으로 적용 될 수 있습니다. 이 모형은 RA 면역 통로의 심층 적인 연구를 위한 기초를 놓는 RA 환자에 있는 CD4 T 세포 및 NKT 세포 적자의 전반적인 증식을 자극할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 등도 독소는 모델링 하는 동안 인터페리톤으로 주입된다.
실험적인 옷과 일회용 장갑을 착용해 주세요. 그리고 찔린 상처를 방지하기 위해 수술의 모든 기준을 수행 감염.
