Este es el primer documento que aborda problemas técnicos en la secuenciación de pequeños ARN derivados de vesículas extracelulares de las células. Las muestras NGS requieren una preparación y un control de calidad estrictos. Debido a la naturaleza de los vehículos eléctricos, el proceso de control de calidad de las muestras EV se desvía de la norma.
La ventaja de este protocolo son los pasos de control de calidad para los usuarios por primera vez. Demostrando el procedimiento estará Junyi Su, una asistente de investigación de mi laboratorio. Para empezar, placa células madre mesenquimales humanas a 2.000 células por centímetro cuadrado en medios MSC frescos en cinco matraces T175.
Luego crecen las células a 37 grados celsius en un 5% de ambiente de dióxido de carbono y reemplazan los medios cada dos o tres días, hasta que se obtengan cinco matraces del 90% de células confluentes. A continuación, lave las células tres veces con 20 mililitros de PBS por matraz. Agregue 20 mililitros de medios de recogida EV en cada matraz.
Y incubarlos a 37 grados centígrados en un 5% de carbono ambiente durante 48 horas. Recoger los medios y centrifugarlo durante 10 minutos a 300 g y cuatro grados Celsius. Luego recoja el sobrenadante, y centrifugar los medios durante 20 minutos a 2.000 g y cuatro grados centígrados.
Recoger el sobrenadante de nuevo, y centrifugar los medios durante 30 minutos a 15, 500 g y cuatro grados Celsius. Recoge el sobrenadante por última vez. A continuación, transfiera el medio a tubos de ultracentrífuga.
Aquí se utiliza un rotor de ángulo fijo 60Ti, y el pellet se anclará al lado del tubo. Marque el lado de la tapa donde se espera el pellet, y dibuje un círculo en el lado del tubo donde se espera el pellet. Y pele el exRNAs durante 90 minutos a 100,000 g y cuatro grados Celsius.
Después de la centrifugación final, retire el sobrenadante. Utilice trozos pequeños de papel absorbente para secar el interior del tubo sin tocar la parte inferior del tubo. Y luego invierta el tubo en un papel absorbente.
Para resuspender el pellet, agregue 200 microlitros de PBS en cada tubo y vórtice el tubo durante 30 segundos. Pipetear arriba y abajo 20 veces. A continuación, evalúe las vesículas extracelulares y otras biomoléculas con análisis de seguimiento de nanopartículas.
Y almacene el pellet en menos 80 grados Celsius hasta que otros experimentos. Después de descongelar las muestras, utilice un kit de aislamiento de ARN para extraer el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluda el ARN de la columna proporcionada en el kit de aislamiento de ARN en 100 microlitros de agua libre de RNAse.
Para concentrar el ARN a través de la precipitación de etanol, agregue un microlitro de glucógeno, 10 microlitros de pH de dos molares-5,5 acetato de sodio y 250 microlitros de etanol preenfriado 99% en 100 microlitros del ARN purificado. Luego incubar las muestras a menos-20 grados Celsius durante la noche para precipitar el ARN. Para peletizar el ARN, centrifugar durante 20 minutos a 16.000 g y cuatro grados centígrados.
A continuación, retire el sobrenadante y lave el pellet de ARN con un mililitro de 75% de etanol. Centrifugar de nuevo durante cinco minutos a 16.000 g y cuatro grados celsius para peletizar el ARN. Retire el etanol y deje la tapa del tubo de ARN abierta durante cinco a 10 minutos para secar al aire el pellet de ARN.
Resuspender el pellet de ARN en siete microlitros de agua libre de RNAse, y utilizar una máquina de electroforesis capilar a base de viruta para detectar la calidad y concentración del ARN. Para comenzar la construcción de la biblioteca, pipetee cinco microlitros del ARN en un tubo PCR pre-enfriado de 0,2 mililitros. A continuación, diluir 3'adaptadores en agua libre de RNAse a una relación de volumen de uno a 10.
Agregue 0,5 microlitros del adaptador diluido en el tubo de ARN y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo ocho veces. Centrifugar brevemente para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo. Incubar la mezcla del adaptador de ARN a 70 grados Centígrados durante dos minutos en un ciclor térmico precalentado.
Y luego coloque la muestra de nuevo en el bloque frío. A continuación, agregue un microlitros del tampón de ligadura, 0,5 microlitros de inhibidor de RNAse y 0,5 microlitros de la ligasa de ARN T4 en la mezcla del adaptador de ARN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo ocho veces, y centrifugar brevemente.
A continuación, incubar el tubo a 28 grados centígrados durante una hora en el ciclor térmico precalentado. A continuación, añada 0,5 microlitros de la solución de parada en el tubo de muestra, con el tubo permaneciendo en el ciclo térmico. Pipetear hacia arriba y hacia abajo ocho veces, y continuar incubando a 28 grados celsius durante 15 minutos.
Diluir 5'adaptadores en agua libre de RNAse a una relación de volumen de uno a 10. Agregue 0,5 microlitros del adaptador diluido en un tubo PCR separado de 0,2 mililitros. Calienta el adaptador de 5' a 70 grados Centígrados durante dos minutos.
Y luego coloque la muestra en el bloque refrigerado. Agregue 0,5 microlitros de 10 nanomol ATP y 0,5 microlitros de la ligasse de ARN T4 al tubo de adaptador de 5'. Pipetear arriba y abajo ocho veces.
Y centrifugar brevemente para recoger todos los líquidos en la parte inferior. A continuación, añada 1,5 microlitros de la mezcla de 5 adaptadores en la muestra de ARN. Pipetear ocho veces muy suavemente, e incubar la muestra a 28 grados centígrados durante una hora.
Para obtener ADNc, diluya la imprimación de transcriptasa inversa en agua libre de RNAse a una relación de volumen de uno a 10. Agregue 0,5 microlitros de la imprimación diluida en la muestra de ARN, pipetear ocho veces muy suavemente y centrifugar brevemente. A continuación, incubar el ARN y la mezcla de imprimación a 70 grados Centígrados durante dos minutos en el ciclor térmico precalentado.
Y luego coloque la muestra en un bloque frío. A continuación, agregue un microlitro de 5X First Strand Buffer, 0,5 microlitros de mezcla DNTP de 12,5 mililitros, 0,5 microlitros de TDT de 100 mililolares, 0,5 microlitros de inhibidor de RNAse y 0,5 microlitros de transcriptasa inversa en el tubo de muestra. Pipetear ocho veces muy suavemente.
Y centrifugar brevemente. Incubar la muestra a 50 grados centígrados durante una hora en el ciclor térmico precalentado. A continuación, añada 4,25 microlitros de agua ultrapura, 12,5 microlitros de la mezcla de PCR, un microlitro de la imprimación de índice y un microlitro de la imprimación universal en la muestra de ADNcl.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo ocho veces, y centrifugar brevemente. Por último, coloque la muestra en un ciclor térmico y configure el ciclor de acuerdo con el manuscrito. Para purificar la biblioteca de ARN, utilice un fraccionador de tamaño de ADN automatizado para eluir las bandas entre 140 y 160 pares base.
Ejecute la biblioteca extraída en un kit de purificación de PCR basado en columnas y eluda la biblioteca en 10 microlitros de agua libre de RNAse. Para comprobar el tamaño de la biblioteca, cargue un microlitro de la biblioteca purificada en un chip de ADN y siga el protocolo del fabricante. Para cuantificar la concentración de la biblioteca, primero diluya un microlitulador de la biblioteca purificada en pH-8.0 tris-Hcl de 10 mililitros con 0,05% de polisorbato 20 en una relación de volumen de uno a 1.000.
A continuación, ejecute QPCR utilizando los estándares de ADN del kit de cuantificación de bibliotecas comerciales. Por último, a la agrupación se agrupan cantidades iguales de las bibliotecas según los requisitos de la máquina de secuenciación y la secuencia en un sistema de secuenciación de alto rendimiento. El electroferograma de ARN extracelulares incluía una amplia gama de ARN.
Por el contrario, el ARN celular mostró picos muy distintos, correspondientes a 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA y 28SrRNA. La calidad resultante de ambas bibliotecas fue alta y comparable. La distribución de longitud de ambas bibliotecas mostró un único pico en 22 nucleótidos, con correlaciones con microRNas.
Por el contrario, las bibliotecas de ARN extracelulares eran más heterogéneas y contenían dos picos más que se correlacionaban con los ARN, las mitades y los fragmentos, o los piRNAs. El 65% de las lecturas de ARN celular se asignaron a microRNas humanos, y cada uno de los otros ARN pequeños representó una pequeña porción de las lecturas asignadas. En contraste, solo el 8% de los ARN extracelulares coincidieron con los microRN humanos.
El ARN pequeño más abundante al que se asignaron las lecturas fueron los ARN, y las lecturas inigualables más tarde coincidían con las secuencias bacterianas. Una comparación con el genoma bovino sugirió que fbS no era una fuente de contaminación. Por lo tanto, los ARN extracelulares presentan un perfil atípico en comparación con el ARN celular normal.
La preparación de la biblioteca es una parte crucial de este protocolo. La mezcla debe hacerse muy suavemente para evitar que se formen burbujas. Este método también se puede utilizar para investigar el perfil de exRNAs de otros tipos de células, lo que ayuda a estudiar la función de exRNAs.
