Los sistemas microfisiológicos tienen la capacidad de emular la farmacocinética y la respuesta toxicológica del cuerpo humano a tratamientos específicos de intereses. Los sistemas microfisiológicos tienen el potencial de reemplazar las pruebas en animales, ya que su uso puede mejorar el poder predictivo de los métodos in vitro y reducir el costo y el tiempo de los estudios farmacocinéticos y toxicológicos. 24 horas antes de la administración de la sustancia de ensayo, dividió una alícuota de 800 microlitros del medio William ES entre los compartimentos más grandes y más pequeños del chip de dos órganos, y aspirar el medio basolateral y apical de cada equivalente de barrera intestinal en las placas de 24 pozos preparadas.
Usando fórceps estériles, integre un circuito de chip de un inserto por dos órganos en el compartimiento más grande y agregue 200 microlitros de DMEMS al lado apical. Usando puntas de diámetro ancho, integre 20 equivalentes hepáticos por circuito en el compartimiento más pequeño de la viruta de dos órganos y conecte el sistema a la unidad de control. A continuación, conecte la unidad de control a un suministro de aire presurizado y ajuste la presión a aproximadamente más o menos 300 barras y una frecuencia de bombeo de 0,3 hercios.
Al día siguiente diluir la solución de paracetamol a una concentración de 12 micromolares. Para reemplazar el medio en el sistema, aspirar el medio basolateral y apical del equivalente de barrera intestinal en el chip de dos órganos y añadir 500 microlitros de medio de cultivo fresco apropiado en el compartimento grande en el lado basolateral organoid y 300 microlitros al pequeño compartimiento. Después de comprobar si hay burbujas, emular la administración oral con la adición de 200 microlitros de una solución de paracetamol de 12 micromolares en el lado apical del cultivo intestinal inserta y conectar el sistema microfisiológico a la unidad de control.
Recoger el volumen total de los lados apical y basolateral intestinal, así como del pequeño compartimento en triplicado en los puntos de tiempo indicados. Una vez recogidas todas las muestras, establezca todos los parámetros pertinentes para el análisis de HPLC como se indica en la tabla y filtre la fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,4 micras al vacío. A continuación, filtre las muestras a través de un filtro de jeringa PVDF de 0,22 micras de tamaño de poro y guárdelos en un vial antes de iniciar la medición UV de HPLC.
Para evaluar la viabilidad organoides, transfiera los 20 esferoides de cada uno se replican a pozos individuales de una placa de 96 pozos y transfiera los insertos de cultivo celular a pozos individuales de una placa de 24 pozos. Lave los equivalentes de tejido tres veces con DPBS fresco por lavado y agregue 300 microlitros de una solución de MTT de un miligramo por mililitro a cada pozo experimental. Después de una incubación de tres horas en la incubadora de cultivo celular, reemplace la solución de MTT con 200 microlitros de isopropanol por pozo para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados para extraer el formazan MTT del intestino y equivalentes hepáticos.
A la mañana siguiente, transfiera 200 microlitros de cada sobrenadante al pozo apropiado en la placa de 96 pozos y lea el formazan en un lector de placas a 570 nanómetros para permitir el cálculo de la capacidad relativa de las células para reducir el MTT utilizando la densidad óptica media de cada punto de tiempo en comparación con el control negativo. Para el análisis citoquímico e histológico de las muestras, primero fije los equivalentes del intestino y del hígado en 4%paraformaldehído en 0,1 PBS molar durante 25 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los organoides cinco veces en PBS durante 10 minutos por lavado, antes de manchar los equivalentes intestinales e hepáticos con tetrametilrhodamine isothiocyanate phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin durante una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, transfiera las muestras al medio de congelación durante unos minutos antes de congelar los tejidos en nitrógeno líquido. A continuación, utilice un criostato para adquirir criosecciones de esferoide hepático de 10 a 12 micras de espesor y monte las secciones de tejido en medio de montaje con DAPI para imágenes mediante microscopía de fluorescencia confocal. Para la tinción mitocondrial y nuclear, cubra completamente las muestras con solución de tinción mitocondrial para una incubación de 15 a 45 minutos a 37 grados celsius en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono.
Al final de la incubación, reemplace cuidadosamente la solución de tinción con 2 a 4%paraformaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, enjuague suavemente las células dos veces con PBS fresco durante cinco minutos por lavado antes de etiquetar las muestras con solución de trabajo de tinción de ácido nucleico durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las muestras con lavados de tres, cinco minutos en PBS protegidos de la luz, y utilice la mancha de ácido nucleico para facilitar la cuantificación del número de manchas mitocondriales que expresan las células en un microscopio fluorescente con los conjuntos de filtros apropiados.
La integración de la barrera intestinal humana y un equivalente hepático en un dispositivo microfluídico con chip de dos órganos permite evaluar las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas de los tratamientos de interés. Después del tratamiento, hpLC puede analizar las muestras de medios. Los organoides pueden ser analizados por su expresión génica, valores de resistencia eléctrica transepilativa, y expresión y actividad de proteínas, así como por sus características morfológicas.
Se pueden realizar análisis de MTT para evaluar la viabilidad organoides, así como para detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento con paracetamol. El flujo de medios no afecta significativamente la absorción de paracetamol, mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente en el hígado, lo que indica que la absorción de paracetamol intestinal humano y el metabolismo hepático se pueden emular en este sistema microfisiológico. Los sistemas microfisiológicos tienen el potencial de reemplazar modelos animales en el desarrollo y descubrimiento de fármacos, ya que imitan mejor la fisiología humana y se pueden utilizar para promover el desarrollo de fármacos a mayor velocidad y menor costo de riesgo y complejidad.
