La barrera hemato -sangre intestinal es un sistema multicapa que controla el paso de nutrientes, metabolitos bacterianos, medicamentos, y otros compuestos exógenos desde el lumen intestinal al torrente sanguíneo. Como sabemos, la integridad de la barrera puede verse afectada en enfermedades gastrointestinales, así como en cardiovasculares y algunas enfermedades metabólicas que pueden resultar en un acceso más fácil de compuestos biológicamente activos como metabolitos bacterianos intestinales al torrente sanguíneo y pueden afectar el funcionamiento de todo el organismo. Por lo tanto, la permeabilidad de la barrera intestino-sangre puede ser un marcador de enfermedades intestinales y extraintestinales.
En este video, presentamos una medición directa de la permeabilidad de la barrera intestinal-sangre en ratas utilizando muestras de sangre portal después de la administración de una sustancia de prueba al tracto digestivo. Describimos en detalle la categorización de la vena porta y la vena cava inferior justo por encima de la confluencia de la vena hepática. El muestreo de sangre de la vena porta y la vena cava inferior permite evaluar no sólo la permeabilidad de la barrera intestinal, sino también una vía de aclaramiento y absorción hepática de moléculas de interés como metabolitos de bacterias intestinales o medicamentos.
Este método prácticamente no está influenciado por la función hepática y renal y preserva el flujo sanguíneo intestinal que es una fuerte ventaja sobre los métodos comunes in vivo e in vitro. Los animales deben ser ayunados durante la noche antes del procedimiento. Realizar todos los procedimientos durante la anestesia general.
Los animales son eutanasiados después del experimento. Nuestro procedimiento comienza con la inserción de la línea para la administración intraintestinal. Aquí proponemos la administración intracolonica del marcador.
Tal vez sea modificado por la administración en varios niveles del tracto digestivo. Por ejemplo, estómago o duodeno. Sin embargo, tenga en cuenta la velocidad variable de la peristalsis y las posibles interacciones con enzimas y ácidos gástricos mientras se administra un marcador en las partes superiores del tracto gastrointestinal.
Utilice el catéter foley pediátrico tamaño 10 F u 8 F como catéter de colon. Marque el catéter para indicar la parte que se insertará en el colon aproximadamente ocho centímetros. Compruebe la región anal y el recuento de las heces en el recto antes de insertar el catéter en el colon.
Si las heces están presentes, vacíe el recto masajeando el área rectal. Coloque un lubricante a lo largo del catéter. A continuación, humedezca el ano y sus alrededores con un lubricante.
Inserte el catéter con un cable guía a través del esfínter anal externo. Haga movimientos lentos hacia adelante, hacia atrás y circulares. Siga comprobando la ubicación del catéter mediante palpación abdominal al insertar el catéter.
El siguiente paso es el cateterismo inferior de vena cava. Puede omitir este procedimiento en estudios de permeabilidad intestinal. Trate de sentir el pulso en la arteria femoral y corte la piel longitudinalmente durante aproximadamente dos centímetros en el lugar donde el pulso es palpable.
Disecciona la fascia y los músculos para visualizar el haz neurovascular. A continuación, diseccionar la vena femoral del haz neurovascular. Primero los nervios, luego la arteria femoral y luego la vena.
Tenga cuidado durante la disección del haz, ya que varias ramas diminutas de la vena femoral pueden dañarse fácilmente. A continuación, ponga dos ligaduras en la vena femoral. No ate los nudos todavía.
Atrapa los extremos de la ligadura proximal con un soporte para agujas. A continuación, tire cuidadosamente de los extremos de la ligadura con el soporte hacia arriba para cerrar la parte proximal de la vena. Espere hasta que la vena esté llena de sangre y ate el nudo distal.
A continuación, haga una pequeña incisión en la vena entre el nudo y la ligadura proximal utilizando tijeras microquirúrgicas. A continuación, inserte el catéter con pinzas o una aguja con un extremo curvo como lo hacemos en el video. Perfore la vena y utilice la punta doblada de la aguja como guía para el catéter.
Afloje la ligadura proximal al insertar el catéter. Inserte el catéter durante aproximadamente seis a siete centímetros dependiendo del tamaño de un animal para colocar la punta proximal del catéter en la vena cava inferior justo por encima de la confluencia de la vena hepática. La colocación correcta del catéter debe confirmarse después del experimento.
Asegure el catéter en la vena femoral con dos nudos quirúrgicos individuales. Ate la ligadura proximal también. Compruebe la patencia del catéter intentando extraer sangre con una jeringa.
Enjuague el catéter con 0,3 mililitros de la solución salina heparinizada. Cierre la herida quirúrgica con dos capas de puntos de sutura individuales. Ahora pasamos al cateterismo de venas porta.
Prepare el catéter del portal. Consiste en una aguja, catéter de poliuretano flexible, punta flexible de polietileno del catéter, tapón y la ligadura. El primer paso del procedimiento es realizar una laparotomía de línea media.
Después de preparar el campo de operación, corte la piel longitudinalmente desde el xifoide del esternón hasta el ombligo. Corte los músculos de la pared abdominal a lo largo de la línea blanca. A continuación, expanda el corte rostralmente en la forma y para que el cartílago xifoide esté entre dos cortes.
El siguiente paso es la disección de vena porta. Primero, humedezca los hisopos con solución salina. Y luego exteriorizar el cecum, colon ascendente y transversal, y el lazo del intestino delgado.
Ponga los intestinos en el lado izquierdo para exponer la raíz del mesentería. Cubre los intestinos con gasa humedecida con una solución salina fisiológica para protegerlos del secado. Para exponer la vena porta mover cuidadosamente los lóbulos hepáticos a los lados o hacia arriba hacia el diafragma con los hisopos humedecidos.
Aquí podemos ver la vena porta y la vena mesentérica superior. Localice la parte de la vena porta que no está cubierta con el mesentería y pase la ligadura debajo de la vena porta. Para proteger los tejidos del daño, humedezca la ligadura con una solución salina fisiológica.
Sujeta con fórceps los extremos de la ligadura y apriétalo suavemente para estabilizar el recipiente. Pase la parte más larga de la ligadura del catéter debajo de la parte libre de la vena porta y tire de ella para que el catéter se encuentre justo al lado de la vena porta. Inserte la aguja en la vena mesentérica superior tres milímetros por debajo de la unión de la vena mesentérica superior y la vena porta.
Sostenga la aguja en un ángulo de 30 grados y después de entrar en la vena reduzca el ángulo y avance la aguja casi horizontalmente en paralelo a la vena porta para una longitud de aproximadamente seis a siete milímetros. Aplique una o dos gotas de pegamento tisú en el lugar donde se inserta la aguja. Retire los hisopos que cubrían el hígado.
Después vuelva a colocar los intestinos en la cavidad abdominal. Humedezca los intestinos con una solución salina calentada y cúbrala con una gasa estéril humedecida. Compruebe la patencia del catéter y enjuague el catéter con solución salina heparinizada.
La sangre venosa se retrofluye espontáneamente en el catéter. Después de cinco minutos comprobar el color de los intestinos y movimientos peristálticos para asegurarse de que se mantiene el flujo sanguíneo mesentérico adecuado. Al final, cierra la cavidad abdominal con tres capas de puntos que exteriorizan la parte distal del catéter alrededor del ombligo.
Para recoger sangre de la vena porta, abra el tapón del catéter porta y deje que la sangre fluya libremente. Use una jeringa y una aguja contundente y no recoja más de 0,7 mililitros de sangre. Enjuague el catéter con solución salina heparinizada y cierre el tapón del catéter.
Aquí presentamos protocolos ejemplares de muestreo de sangre portal para la evaluación de la permeabilidad intestinal. Las muestras de sangre de la vena cava inferior son necesarias para los estudios de aclaramiento hepático y absorción. Para recoger la sangre de la vena cava inferior proceder exactamente como cuando se toma sangre de la vena porta.
Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre ejemplar para la medición del aclaramiento hepático y para el seguimiento de la vía sanguínea sistémica del portal intestinal de compuestos seleccionados. En nuestros estudios utilizamos un metabolito bacteriano, trimetilamina como marcador de permeabilidad. Sin embargo muchas otras sustancias, incluyendo marcadores de permeabilidad de clase pueden ser utilizados también.
Varias bacterias y metabolitos y tractos también se pueden utilizar para tratar la vía de absorción o aclaramiento hepático. Retire el cable guía e infle el globo utilizando un volumen adecuado de agua estéril generalmente un mililitro, pero compruebe el tamaño del globo antes de la inserción. El diámetro del globo no debe exceder un centímetro.
Coloque la cabeza de la rata hacia abajo para minimizar el riesgo de salida de la solución administrada del colon. Administrar lentamente la sustancia probada utilizando el puerto de drenaje y el catéter colonico. Usamos trimetilamina en una dosis de 100 miligramos por kilogramo de peso corporal disuelto en 0,7 mililitros de solución salina.
Después de diez minutos desinflar el globo del catéter. El aclaramiento hepático entendido como extracción hepática puede expresarse por la diferencia entre la concentración sanguínea del portal y la concentración de sangre de vena cava inferior o por la proporción de vena cava inferior y concentración de sangre portal. Hemos medido con éxito la permeabilidad de la barrera intestinal y el aclaramiento hepático de trimetilamina en ratas.
Estos son los resultados representativos que demuestran que las ratas hipertensas han aumentado la permeabilidad del colon a la TMA en comparación con las ratas normotensivas. En otra investigación estudiamos si la ingesta alta de sal afecta la permeabilidad de la barrera intestinal y el aclaramiento hepático de trimetilamina. La administración intracolonica de trimetilamina produjo un aumento significativo en la concentración de TMA en sangre portal.
El tamaño del aumento y el aclaramiento hepático fueron similares entre los grupos. También rastreamos la vía de absorción de los ácidos grasos de cadena corta. Medimos la concentración en heces, sangre portal y sangre periférica.
En este video describimos un protocolo integral que incluye la medición directa de la permeabilidad de la barrera intestinal in vivo que, a diferencia de los métodos de uso común, no se ve afectada por las funciones hepáticas y renales, la medición del aclaramiento hepático, y la tercera, evaluación de la vía de absorción de compuestos exógenos. La técnica presentada puede ajustarse a otros fines experimentales. Por ejemplo, la medición de la presión arterial portal o la administración de medicamentos directamente a la vena porta.
