La técnica de grabación de baño se utilizó por primera vez por Fricke (1984) 8 y Beall et al. (1990) 9 para medir los campos eléctricos generados en la cola mueve de un tirón. La técnica fue posteriormente modificada y mejorada en el laboratorio del Dr. Donald Edwards (Georgia State University) por su ex estudiante graduado de Dr. Fadi A. Issa y su ex asociado postdoctoral Dr. Jens Herberholz. Otras mejoras se han hecho y las nuevas aplicaciones de investigación han sido probados en el laboratorio del Dr. Jens Herberholz en la Universidad de Maryland. Me gustaría agradecer a mi colega, el Dr. David Yager por dejarme usar su sistema de alta velocidad de vídeo y mis asistentes de investigación David Rotstein y Liden William para obtener ayuda con los experimentos.

Parte 1: cámara de grabación <ol><li> La cámara de grabación es de forma rectangular y está hecha de vidrio de paredes delgadas. Dimensiones de la cámara son de 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (largo x ancho x alto) para los animales de 2,5 a 3,5 cm de longitud total (medida a partir de tribuna para telson). Ver fig. 1 para un ejemplo de una cámara utilizada en nuestros experimentos. </li><li> Por otra parte, las cámaras de grabación se puede hacer con otros materiales (por ejemplo, no tóxica de plástico transparente). Tamaño de las cámaras puede variar de acuerdo con el procedimiento experimental y las cámaras debe ser personalizado para cada serie experimental. Para mejores resultados, tamaño de la cámara debe ser lo más pequeña posible, sin restricción de los animales en su comportamiento natural. Como regla general, la longitud y la anchura de la cámara no debe tener más de tres veces el tamaño del animal. </li></ol> Parte 2: Baño de electrodos y alambre de tierra <ol><li> Un par de electrodos de registro y un electrodo de tierra se utilizan. Los electrodos están hechos de alambre de cobre aislado (26 AWG con aislamiento de 0,25 mm). Uno de los extremos de los electrodos de baño está conectado a un amplificador extracelular (AM Sistemas de 1700, véase más adelante) y 0,5 - 1,0 mm de aislamiento se quitó el otro extremo. El cable de tierra está conectada a la tierra del amplificador o cualquier otro equipo conectado a tierra y 2.3 cm de aislamiento se quitó el otro extremo. </li><li> Electrodos de baño y conexión a tierra se unen a las paredes interiores de la cámara de grabación con pegamento no tóxico. Electrodos de registro se colocará en el centro en ambos lados cortos de la cámara y opuestas entre sí (Fig. 1). </li><li> Electrodo de masa se coloca en un lado largo de la perpendicular de la cámara de grabación para los electrodos de registro (Fig. 1). </li><li> Cámara se llena con agua destilada. Los mejores resultados se obtienen con agua de alta resistencia (~ 18 MW). </li></ol> Parte 3: Las grabaciones de baño electrodo <ol><li> Las salidas de electrodos de registro se amplifican (1000x) por un amplificador extracelular (Sistemas de AM, modelo 1700). Señal de los electrodos de registro se filtra utilizando una combinación de baja frecuencia (&lt;100 Hz) y alta frecuencia de corte (&gt; 5 KHz). La señal se conecta a una caja de distribución y una tarjeta de adquisición de datos (National Instruments). Los datos digitalizados se registra, almacena, y se analizaron usando el software de adquisición de datos (Photron Herramientas de movimiento). </li><li> Por otra parte, la señal amplificada de electrodos de registro se pueden digitalizar con otros convertidores analógico-digital (por ejemplo, MDS tecnologías analíticas; Digidata 1440) antes de los datos digitalizados se registra el uso de software de otros datos disponibles en el mercado de adquisición (por ejemplo, MDS tecnologías analíticas; Axoscope). </li></ol> Parte 4: Estimular la investigación <ol><li> Una sonda de estimulación se hace de una pipeta de vidrio (14 cm de longitud), equipado con un par de electrodos de alambre fino. Puntas de los electrodos están expuestos (0,2 mm) para producir una señal electrónica cuando el animal está tocado por la sonda. Esto permite medir el tiempo exacto de la estimulación. </li><li> Resultados de la sonda estimulante se amplifican (1000x) por un amplificador extracelular (Sistemas de AM, modelo 1700). Se filtra la señal mediante una combinación de baja frecuencia (&lt;100 Hz) y alta frecuencia de corte (&gt; 5 KHz). La señal se conecta a una caja de distribución y una tarjeta de adquisición de datos (National Instruments). Los datos digitalizados se registra, almacena, y se analizaron usando el software de adquisición de datos (Photron Herramientas de movimiento). </li></ol> Parte 5: Las grabaciones de vídeo <ol><li> Una cámara de video de alta velocidad (FastCam-X 1280 PCI, Photron) se coloca perpendicular a la cámara de registro para proporcionar una vista lateral. Nivel de brillo dentro de la cámara de registro debe ser ajustado para proporcionar los mejores resultados, por ejemplo, mediante el uso de un iluminador de cuello de ganso o de otras fuentes de luz enfocable. </li><li> Videografía de alta velocidad se combina y se sincronizan con grabaciones electrónicas utilizando una caja de conexiones y datos de tarjeta de adquisición (National Instruments). Señal amplificada de los electrodos de baño está conectado a la caja de conexiones y tabla de adquisición de datos utilizando cables BNC. Externo a mano el interruptor de disparo inicia la adquisición sincronizada de vídeo y datos. </li></ol> Parte 6: El procedimiento experimental <ol><li> Un solo animal se introduce en la cámara y se les permitió aclimatarse durante 5 minutos. Escapar de la cola-flips son provocados por los grifos individuales de diferente intensidad en la cabeza o el abdomen, respectivamente. La intensidad de los grifos es controlado por el experimentador. Cada cola de escape-tapa está grabado con video de alta velocidad a una velocidad de 1000 f / s, y los puntos de datos de los potenciales de campo electrónico se registran a 25 kHz. Inicio de la bañera y grabación de vídeo se inicia con interruptor manual en una caja de disparo. El tiempo de grabación está determinado por la velocidad de fotogramas seleccionados (por ejemplo, 1000 f / s = 4 segundos el tiempo total de grabación). Post-y pre-trigger tiempos de grabación se puede seleccionar. </li><li> Noe: grabaciones de baño electrodo debe ser verificado una vez para cada especie estudiada mediante la combinación de grabaciones de baño electrodo con otros métodos de grabación disponible. En cangrejos de río, un par de electrodos de plata puede ser implantado quirúrgicamente en todo el cordón nervioso ventral. Estímulos provocando la cola-flips de escape pueden ser aplicadas y registradas las huellas electrónicas de electrodos implantados y baño se pueden comparar. </li><li> Escapar de la cola-flip comportamiento y la actividad neuronal correspondiente se puede grabar en una variedad de contextos diferentes, por ejemplo, en respuesta a las amenazas visual, durante los ataques de los depredadores, o durante los encuentros agonísticos de dos cangrejos de río. Tamaño de la cámara, modo de grabación, etc tiene que ser ajustado en consecuencia (ver Discusión). </li></ol> Parte 7: Análisis de los datos <ol><li> Cuadros de vídeo individuales se analizaron mediante el software de movimiento de la herramienta (Photron). Huellas electrónicas se utilizan para identificar el tipo de circuito neural que se activa por cada estímulo. Los datos de video se compara con las grabaciones sincronizadas fisiológicas para determinar el movimiento de los animales y el circuito neuronal activado. Cada circuito activado produce una firma característica electrónico (ver resultados representativos). </li><li> Latencia entre el contacto de la sonda y la respuesta neural / muscular se calculan para cada experimento midiendo el retraso entre el inicio de la señal de la sonda y la aparición de la señal grabada con los electrodos de baño. </li></ol> Parte 8: Los resultados representativos Una serie de fotogramas de vídeo individuales de alta velocidad y sus correspondientes grabaciones de campo eléctrico para escapar de la cola-flip en respuesta a un estímulo táctil entregado a la cabeza o la cola de un cangrejo de río juvenil (Fig. 2). Fig. 2A: fuerte estímulo táctil en la cabeza provocado una cola de flip-controlada por el gigante del circuito medial. El alza registrada por la neurona gigante (asteriscos) y la desviación de grandes fásica que sigue permite identificación no-ambigua de la cola-flip, mediada por la actividad de las neuronas gigantes. El retroceso se muestra en las huellas de vídeo determina la identidad de los circuitos neuronales activados (MG). Fig. 2B: Cola-flip mediada por el circuito gigante lateral después de un fuerte estímulo táctil se aplicó a la cola. Movimiento hacia arriba y hacia delante se ve en el video junto con los rastros de la traza sincronizada electrónica que muestra el enorme pico y la desviación grande, inicial fásica determina la identidad de los circuitos neuronales activados (LG). Fig. 2C: Cola-flip controlados por circuitos no gigantes. Un estímulo táctil más gradual fue entregado en el tórax del animal. Mientras que el movimiento capturado en video no permite la identificación inequívoca del circuito se activa, el registro electrónico no tiene un pico enorme y consiste en la identificación de desviaciones mucho menor el circuito activo (no-G). Fig. 3: Las mediciones de latencia para los tres tipos de escapar de la cola-flips. Tiempo entre el contacto de la sonda y la respuesta fisiológica se midió por siete animales. Gigante mediada por la cola-flips son provocados significativamente más rápido que no gigantes cola mueve de un tirón. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> Figura 1: Un ejemplo de una cámara de registro utilizado en nuestros experimentos en animales de 2,5-3,5 cm de longitud total. Los electrodos de baño están pegados a los lados opuestos de la cámara, mientras que el cable de tierra está conectada a la parte larga de la cámara y perpendicular a los electrodos de baño. Figura 2: los solos marcos video grabado en 1000 grabaciones f / s, y que corresponde electrónicos para tres diferentes tipos de estimulación. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) Un estímulo táctil fuerte fue entregado a la cabeza del animal y obtuvo un gigante medial (MG) ​​mediada por la cola-flip. Seis de vídeo se muestran imágenes de la izquierda. Rastro de grabación de la sonda utilizada para tocar el animal se muestra en gris, el punto de contacto se indica por la flecha negro. Rastrear la grabación obtenida con los electrodos de baño se muestra en azul. El recuadro muestra la punta del axón gigante pequeño que precede a las desviaciones fásica grandes. Barras grises corresponden a los fotogramas de vídeo, muestra a la izquierda. El primer movimiento notable de la cola del cangrejo de río se produjo en el marco # 3, siete milésimas de segundo después del contacto con la sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) Un estímulo táctil fuerte fue entregado a la cola del animal y obtuvo un gigante lateral (LG) mediada por la cola-flip. Seis de vídeo se muestran imágenes de la izquierda. Rastro de grabación de la sonda utilizada para tocar el animal se muestra en gris, el punto de contacto se indica por la flecha negro. Rastrear la grabación obtenida con elelectrodos de baño se muestra en rojo. El recuadro muestra la punta del axón gigante pequeño que precede a las desviaciones fásica grandes. Barras grises corresponden a los fotogramas de vídeo, muestra a la izquierda. El primer movimiento notable de la cola del cangrejo de río se produjo en el marco # 3, ocho milésimas de segundo después del contacto con la sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) Un estímulo táctil débil y gradual fue entregado a la cabeza del animal y obtuvo un no gigante (Non-G) mediada por la cola-flip. Ocho de vídeo se muestran imágenes de la izquierda. Rastro de grabación de la sonda utilizada para tocar el animal se muestra en gris, el punto de contacto se indica por la flecha negro. Rastrear la grabación obtenida con los electrodos de baño se muestra en negro. La huella no tiene el gigante potencial pico, las desviaciones iniciales grandes y se compone de los potenciales de amplitud mucho menor. Luz barras grises corresponden a los fotogramas de vídeo, muestra a la izquierda. El primer movimiento notable de la cola del cangrejo de río se produjo en el marco # 6, 115 milésimas de segundo después del primer contacto con la sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> Figura 3: Medidas de respuesta de latencia de siete animales diferentes, de ambos sexos y tamaños similares (media ± stdv longitud: 3,2 cm ± 0,2 cm, medida desde tribuna para telson). MG (barra azul) y LG (barra roja) cola invierte significativamente menor latencia de respuesta que la cola mueve de un tirón-mediada por la no-G (barra de color negro) de circuitos. Medias y desviaciones estándar se muestran. Barras con la misma letra no difieren significativamente entre sí (test de Wilcoxon para la comparación por pares, p &lt;0,05).

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	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

No invasiva de las grabaciones de la actividad de las neuronas individuales o activación de circuitos neuronales son difíciles de obtener en los animales sin restricciones. El método descrito aquí proporciona un medio para identificar los patrones de activación neuronal subyacente natural comportamiento. En el pasado, hemos utilizado con éxito esta técnica para medir los patrones de actividad en los circuitos neuronales de escape de los cangrejos de menores durante la formación de je...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

La relación entre los patrones de actividad neuronal y la expresión del comportamiento que corresponde es difícil de establecer en los animales sin restricciones. Tradicionales métodos no invasivos requieren los sujetos de investigación, al menos parcialmente restringido, y sólo permiten la identificación de un gran número de neuronas al mismo tiempo activa. Por otro lado, pequeños conjuntos de neuronas o de las neuronas individuales sólo pueden medirse utilizando una sola célula grabaciones obtenidas a partir de preparaciones reducido en gran medida. Dado que la expresión del comportamiento natural de los animales es limitada en contenido y disecados, los mecanismos subyacentes a los nervios que controlan el comportamiento son difíciles de identificar. Aquí les presento una técnica fisiológica no invasiva que permite medir la activación de circuitos neuronales en comportarse libremente los animales. Con un par de electrodos de alambre dentro de una cámara llena de agua, los electrodos de baño de registrar los potenciales de campo neuronal y muscular generada por cangrejos juveniles durante las respuestas de escape natural o inducidas experimentalmente. Las respuestas de escape primario de cangrejos de río están mediados por tres tipos diferentes de cola-flips que se mueven los animales lejos del punto de estimulación. Cada tipo de cola de la moneda es controlada por su propio circuito neuronal, los dos mejores y más poderosas respuestas de escape requieren la activación de los diferentes conjuntos de neuronas de comandos de gran tamaño. En combinación con observaciones de la conducta, las grabaciones de electrodos baño permiten una identificación inequívoca de las neuronas y los circuitos asociados neural. Así, la actividad de los circuitos neuronales que subyacen al comportamiento natural se puede medir en los animales sin restricciones y en diferentes contextos de comportamiento.

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Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Mediciones no invasivas de los patrones de actividad neuronal en animales de comportarse libremente se obtienen mediante la combinación de grabaciones neurofisiológicas con videografía de alta velocidad.

Grabaciones de la activación de circuitos neuronales en animales comportarse libremente

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

recordings-of-neural-circuit-activation-in-freely-behaving-animals

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K vistas.  University of Maryland. Mediciones no invasivas de los patrones de actividad neuronal en animales de comportarse libremente se obtienen mediante la combinación de grabaciones neurofisiológicas con videografía de alta velocidad.

Video: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Las grabaciones de células enteras del cerebro del adulto de Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Investigación

Biología

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Medidas de las frecuencias cardíaca y respiratoria en movimiento libre del cangrejo de río

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RHOC GTPasa ensayo de activación

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modelado de membranas biológicas con placas de circuitos y medición de señales eléctricas en los axones: Ejercicios de laboratorio para estudiantes

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.