Las respuestas neuronales dan una idea de la actividad cerebral, pero pueden variar entre experimentos e individuos. Este protocolo ayuda automatizando el registro y análisis de la estimulación, y simplificando la programación de diferentes tipos y patrones de estímulos. La técnica automatizada permite grabaciones para múltiples neuronas y organismos en el mismo formato microfluídico en paralelo.
Esto mejora la repetibilidad de las grabaciones y permite la exploración de la variabilidad neuronal entre poblaciones. Se necesitan diferentes patrones de estimulación para revelar fenómenos neuronales como la adaptación y la integración sensorial. Este método es generalizable a otras señales dinámicas de células y organoides a organismos y plantas.
Para comenzar, encienda el microscopio, llene y retire las burbujas de aire del tubo del depósito con la jeringa de cebado, luego llene el tubo de salida con tampón. Retire el dispositivo microfluídico del desecador de vacío. Coloque el dispositivo en el microscopio e inserte rápidamente el tubo de salida.
Empuje suavemente la jeringa de salida para inyectar líquido en el dispositivo hasta que una gota emerja de una entrada. En esta entrada emergente de gotas, use una conexión gota a gota para insertar el tubo de entrada fluídico correspondiente, asegurándose de que las gotas de líquido estén presentes tanto en el tubo de entrada como en el ojo de buey del dispositivo para evitar la introducción de una burbuja. Conecte el siguiente tubo de entrada a la siguiente gota.
Inyecte más líquido de la salida si es necesario y repita hasta que todas las entradas estén llenas. Inserte un pasador de bloqueo sólido en las entradas no utilizadas y en el puerto de carga del gusano. Compruebe el flujo en la pantalla para asegurarse de que el flujo va en la dirección deseada.
Gire la válvula uno en el controlador de la válvula y observe el flujo de estímulo que fluye hacia la arena microfluídica. Si el flujo está desequilibrado, ajuste las alturas del depósito. Transfiera los animales adultos jóvenes a un medio de crecimiento de nematodos sin semillas o placa de agar NGM usando un pico de punta de alambre, luego inunde la placa con aproximadamente cinco mililitros de un amortiguador basal XS para que los animales puedan nadar.
Extraiga los gusanos en una jeringa de carga de uno a tres mililitros utilizando el tubo conectado precargado con un tampón basal XS. Usando un estereoscopio, mueva el tubo debajo de la superficie del líquido con una mano a cada animal deseado y tráigalo hacia el tubo usando la jeringa que se sostiene en la otra mano. Cierre el contorno de la salida, retire el pasador de carga del gusano y conecte la jeringa de carga del tornillo sin fin al dispositivo mediante una conexión gota a gota.
Luego fluye suavemente a los animales hacia la arena. Establezca el flujo amortiguador y espere hasta una hora para la inmovilización por tetramisole. Con el editor de texto, cree un archivo de texto de definición de estímulo denominado userdefinedacquisitionsettings.
TXT que contiene los ajustes de estimulación para la adquisición automatizada de imágenes. Este archivo define los parámetros de adquisición del microscopio, como el tiempo de exposición y excitación, la duración del ensayo, los intervalos y el directorio de guardado. También define el tipo de experimento y los ajustes de tiempo de estimulación.
Para un solo experimento de estímulo, use un formato con un solo comando de estimulación repetida. Para un experimento de patrones múltiples, use un formato con múltiples comandos de estimulación incluyendo una secuencia de patrones de dígitos que represente el orden de los patrones de estímulo. Para cada patrón, introduzca un comando de estimulación en una línea separada.
A continuación, ejecute el software de control del microscopio. Verifique que todas las entradas fluídicas estén abiertas, que el flujo se desee dentro de la arena y que las neuronas de interés estén enfocadas dentro de la ventana en vivo. A continuación, cierre la ventana activa y ejecute el script multipatternrunscript.
BSH dentro del software. Para analizar los datos, ejecute NeuroTracker haciendo clic secuencialmente en los complementos, luego en el seguimiento y luego en NeuroTracker. Seleccione la carpeta que contiene los archivos de vídeo tiff a seguir y seleccione el rango de archivos que se procesarán.
A continuación, utilizando los menús de imagen y ajuste, abra las ventanas de contraste de brillo y control de umbral. Compruebe el fondo oscuro y no restablezca el rango en la ventana de umbral, estableciendo el método de umbral en predeterminado y la visualización en rojo. Luego haga clic en automático en la ventana de contraste de brillo para la visibilidad de las neuronas.
En la ventana de contraste de brillo, ajuste los controles deslizantes mínimo y máximo hasta que las neuronas sean claramente distinguibles. Luego ajuste el nivel umbral hasta que todas las neuronas aparezcan como pequeñas manchas rojas separadas de otros objetos. Ajuste el control deslizante del marco para observar el movimiento de la neurona y los cambios de intensidad, observando cualquier animal que deba excluirse del seguimiento, como debido a la superposición con otros animales.
Después de identificar las neuronas para el seguimiento, ajuste el nivel umbral para cada animal si es necesario, de modo que el área de umbral rojo sobre la neurona sea visible en cada cuadro. Haga clic en la neurona para registrar su posición y nivel de umbral. Cuando todas las neuronas estén seleccionadas, presione la barra espaciadora para comenzar el seguimiento.
Supervise el proceso de seguimiento de cada animal y realice las correcciones necesarias. Si NeuroTracker se detiene, pierde la neurona. Ajuste el nivel de umbral según sea necesario y vuelva a hacer clic en la neurona.
Si el cuadro de integración salta a otro animal cercano o estructura no neuronal, presione la barra espaciadora para pausar. Mueva el control deslizante de nuevo al primer fotograma erróneo y vuelva a hacer clic en la ubicación correcta de la neurona. Ejecute el neurotrackersummarypdf.
m en MATLAB y seleccione la carpeta que contiene los archivos de texto de datos de NeuroTracker. Espere a que se genere un PDF de resumen, lo que permite la verificación del proceso de seguimiento. Los animales pueden ser identificados por los números y las respuestas neuronales de cada animal y ensayo y ser vistos para evaluar la variabilidad de la población.
Utilice la función Databrowse. m para explorar los datos neuronales agrupados por número de ensayo, número de animales, patrón de estimulación o por otra categoría. El fenómeno de inhibición temporal se probó en un experimento de pulso pareado que produjo ocho patrones que consisten en dos pulsos odorantes de un segundo separados por un intervalo que varía de cero a 20 segundos.
El primer pulso de olor de un segundo provocó una magnitud de respuesta igual en las neuronas AWA que detectaban diacetilo y las respuestas en el segundo pulso variaron con el intervalo interestímulo. La desinhibición se evaluó mediante el experimento de prueba de captura donde se observó adaptación al estímulo diacetil, pero la presentación del nuevo estímulo 2-metilpirazina no provocó un fuerte efecto de desinhibición. La estimulación multimodal probada reveló que la estimulación química sola causó adaptación, mientras que la estimulación óptica sola no lo hizo.
Sin embargo, el patrón de estímulo multimodal combinado demostró que las respuestas optogénicas eran susceptibles a la adaptación inducida químicamente. Al modificar el diseño microfluídico para incluir dos arenas, podemos comparar perturbaciones genéticas o de otro tipo junto con una referencia coincidente al mismo tiempo. Una vez configurado, el sistema se puede modificar de muchas maneras.
Por ejemplo, hemos medido automáticamente las respuestas a la dosis química y los cambios dependientes del estado en la actividad neuronal, como entre los estados de sueño y vigilia.
