Agradecemos al Dr. Randy Chitwood para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Whitehall y la Alfred P. Sloan Foundation otorga a HJK.

1. Configuración óptica (Figura 1) <ol><li> Para dos fotones de excitación un sistema de infrarrojos láser pulsado con pulsos de femtosegundos se utiliza. Un láser de potencia de salida alta (en algunos casos&gt; 2W en longitud de onda nm 890) es necesaria para compensar las grandes pérdidas introducidas por los componentes ópticos del sistema. </li><li> Un sistema prechirper que consta de dos prismas imparte una dispersión grupo velocidad negativa (EVI) en los pulsos de láser antes de los deflectores acústico-ópticos (ordenadores delegados) para compensar la dispersión temporal introducida por el ordenadores delegados 1. </li><li> Dos ordenadores delegados con aberturas grandes (10 mm para un objetivo de inmersión en agua 40x con NA 0,8) desviar el haz de láser en dos dimensiones. </li><li> Una red de difracción reflexivo con 100 huertos / mm se coloca 13 cm por detrás de los ordenadores delegados para compensar la dispersión espacial introducida por los ordenadores delegados al usar pulsos cortos de láser. </li><li> El rayo láser se dirige con dos telescopios de relé en el puerto de la cámara de un montante microscope. </li><li> Iris están colocados a intervalos regulares para la alineación de los componentes ópticos. </li><li> Un divisor de haz dicroico en frente del objetivo transmite la luz de excitación infrarroja para la muestra y refleja la luz de fluorescencia de la muestra a un detector. </li><li> Detectores de Epi-y transfluorescence (fotomultiplicadores, PMT) recoger la señal de fluorescencia a través del objetivo y - en su caso - a través del condensador. </li><li> Filtros de vidrio de color (BG-39, 3-5 mm) se colocan delante de los detectores para evitar que la luz de excitación alcanzar los detectores. </li><li> Los ángulos de deflexión de AOD están controlados por un ordenador equipado con una tarjeta digital-analógico convertidor (156,25 kHz frecuencia de reloj), que a su vez acciona tensión osciladores controlados. </li><li> La señal de los fotomultiplicadores se retransmite a través de un filtro de paso bajo Butterworth (frecuencia de corte de 100 kHz) y digitalizada por un convertidor analógico-digital converter (156,25 tasa de reloj kHz) antes de ser almacenado enun ordenador para su análisis. </li><li> La alineación y el ruido eléctrico se prueban mediante el registro de la distribución de las señales de fluorescencia con y sin luz láser, en ganancia baja y alta de los fotomultiplicadores, así como con y sin indicador. El escáner está correctamente configurado y protegido cuando la anchura de la distribución de las señales de fluorescencia en ganancia alta y con indicador es mucho más grande que las anchuras de las otras distribuciones de señales de fluorescencia (Fig. 2). </li></ol> 2. Los procedimientos experimentales <ol><li> Dithered azar escaneado en acceso se basa en la detección de los aumentos intracelulares de calcio. Un gran número de neuronas se pueden teñir utilizando inyección en bolo de la forma de éster de un indicador de calcio (por ejemplo Oregon Green 488 Bapta-1 AM) en el tejido neural 5. </li><li> Varios lugares de cada soma neuronal se registran, cada uno por un corto tiempo (&quot;dithering&quot;, 4 lugares, 6,4 ms para cada ubicación = 25,6 ms de tiempo de grabación para el correoACH neurona en cada ciclo, la fig. 3C). Para seleccionar las neuronas de interés un marco completo que consta de 256x256 píxeles se adquiere (Fig. 3A). El centro de cada soma neuronal a grabar se selecciona manualmente dentro de esta imagen. El software de control añade tres puntos a una distancia de 2 m alrededor de este centro. </li><li> En cada ciclo, la señal de fluorescencia se registra a partir de cada una de las 40 neuronas (Fig. 3B). Este proceso se repite para toda la duración de una grabación (5 segundos de grabación = 3255 ciclos, 1 ciclo = 1,536 ms). </li></ol> 3. Las herramientas en línea de software para maximizar la eficiencia de detección de pico <ol><li> Detección de pico de las señales de fluorescencia de calcio somáticas se basa en una alta relación señal-ruido (S / N) de las señales de calcio somáticas de fluorescencia. Una alta relación S / N se puede lograr mediante el aumento de la intensidad de excitación. Intensidad de excitación, sin embargo, sólo se puede aumentar hasta un cierto límite, porque de fotodaño. Detección Spike es alta dentro de una windo muy pequeñow de las intensidades de excitación sólo cuando las señales de fluorescencia tienen una alta relación S / N, pero sólo muy poco daño solar es observado 3. Con el fin de garantizar que las señales grabadas están dentro de la ventana de detección de pico de alta durante grabaciones que controlar la frecuencia de fotones (véase la ecuación 3,2) y disminución del nivel de referencia de fluorescencia utilizando el análisis en línea. </li><li> Tasa de fotón aproximado por neurona se calcula a partir de una ventana de tiempo corto (100-200 ms) de ruido de línea base. Tasa de número de fotones (N λ) y el fotón (λ = λ N / Dt) se calcula a partir de los valores de fluorescencia mediante el ajuste de la distribución (σ) de los cambios relativos de fluorescencia con la siguiente ecuación: </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> Esta ecuación representa la distribución de Poisson para el ruido de disparo fotón con un cambio de variable con el cambio de fluorescencia relativa: Df / F = (G * N λ (t)-G * N + lambda, 0,) / G * N λ, 0 donde G denota la ganancia acumulada del fotomultiplicador y todos los componentes electrónicos. Tenga en cuenta que esta ecuación no determina correctamente el número de fotones detectados para grabaciones en vivo porque hay otras fuentes de ruido (artefactos de movimiento), además de ruido de disparo fotón. Sin embargo, esta ecuación es útil para grabaciones en vivo para estimar el ruido. <ol start="3"><li> De fluorescencia base se calcula a partir de la misma ventana de tiempo y se representa como una función del tiempo o ensayos. El descenso medio de línea de base se mantiene por debajo de 0,0002 / s mediante el ajuste de la potencia del láser ya que la detección pico disminuye rápidamente cuando se excede este límite. </li><li> Cada 10-20 minutos las posiciones somas neuronales son verificados por la adquisición de nuevo una imagen a pantalla completa. Si es necesario, las ubicaciones de grabación son ajustados. Las localizaciones pueden ser ajustados para todas las neuronas a la vez, o para las neuronas individuales. </li></ol> 4. Reconstruction de horarios pico de las señales de fluorescencia (deconvolución) <ol><li> Las señales de fluorescencia resultantes de la actividad neural a menudo summate en el tiempo debido a la descomposición de los transitorios de calcio es largo (varios cientos de milisegundos). Un método de deconvolución reconstruye horarios pico y pico de las señales de fluorescencia. </li><li> Para determinar el tren pico más probable que subyace a la señal de fluorescencia registrada, diferentes modelos se comparan. Aquí hemos utilizado un algoritmo genético para determinar el modelo - y por tanto el tren de pico y tiempos de punta - con la máxima verosimilitud. </li><li> En las poblaciones no homogéneas de las neuronas, la espiga-evocado señal de calcio puede variar entre las neuronas. Para el análisis no supervisado de los conjuntos de datos que hemos diseñado un algoritmo que tiene en cuenta la variación de la señal de calcio espiga-evocada de una neurona a otra. </li><li> Para evitar un gran número de detecciones de falsos positivos es útil para constreñir la amplitud permitida y el tiempo constante de desintegración del modelo de la señal de calcio punta-evocado. La distribución conjunta de la amplitud y el tiempo constante de desintegración de un solo pico transitorios de calcio evocadas se registran en un conjunto separado de experimentos del mismo tipo de neuronas en las mismas condiciones experimentales usando simultáneas registros electrofisiológicos y óptica. </li><li> Para dar cuenta de los cambios lentos de referencia y reducir los costes computacionales de deconvolving, grabaciones más largas se dividen en varios trazos cortos de 1-5 segundos. </li><li> Para cada neurona y cada grabación, el algoritmo de deconvolución puede probar un gran número de modelos (de hasta un millón de diferentes modelos o más). Para acelerar la deconvolución, un experimento se deconvolved en hasta 10 equipos diferentes en paralelo. </li><li> Después de la deconvolución, la espiga de datos se analiza y se inspeccionó. Un histograma de tiempo de peri-estímulo, la probabilidad de espiga, y la tasa de disparo (media espiga por las neuronas) se calculan de una manera automatizada. </li></ol> 5.Los resultados representativos El éxito de espiga bisagras de detección en una alta relación señal a ruido de las señales de fluorescencia grabadas calcio somáticas. Simplemente usando altas tasas de excitación (láser de alta potencia) puede resultar en un impacto adverso de photoeffects en material biológico (fotoenvejecimiento). En fotodaño interpolado de exploración de acceso aleatorio se manifiesta como una disminución en la fluorescencia basal y disminuye las señales de calcio punta-evocados fluorescencia. La disminución en la señal de pico-evocó rápidamente puede resultar en una falta de detección de picos. Sólo hay una ventana muy pequeña de la intensidad de excitación en la detección de pico de las señales de fluorescencia es alta. En el extremo superior esta ventana está limitada por fotodaño, en el extremo inferior de las señales de fluorescencia tienen una baja relación señal-ruido. Para neuronas corticales en rodajas agudas usamos la potencia del láser se traduce en tasas de fotones de unos 400,000-1,500,000 fotones / s cuando se graba a unos 100 m por debajo de la superficie de corte. Cuando se usa un alto-Afinidad indicador - aquí Oregon Green 488 BAPTA - 1 - Esta señal es suficiente para detectar picos individuales. La figura. 3E muestra un ejemplo de una señal de fluorescencia de excitación grabar a una velocidad muy baja, un ejemplo de una grabación dentro de la ventana de detección, y uno a la tasa de excitación muy alta. En comparación con otras técnicas para registrar la actividad neuronal en la resolución de una sola célula y de un solo pico, interpolado de acceso aleatorio exploración puede grabar de un mayor número de neuronas de la misma población, local, y es menos invasiva, por ejemplo, en comparación con las grabaciones tetrodo / multielectrode . Así interpolado de acceso aleatorio escaneado se puede utilizar para registrar la actividad neural de muchas neuronas para medir la información mutua señalado por la actividad supra-6 (Fig. 4A), los cambios de actividad neural en una población de neuronas (plasticidad cortical), y la propagación de la actividad suprathreshold a través de poblaciones de neuronas 14 (Fig. 4B) <img<html> alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Diseño óptico de la configuración de acceso aleatorio interpolado-exploración. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> Figura 2 Alineación y pruebas:. Distribuciones de señales de fluorescencia grabadas en diferentes condiciones. A) No hay luz láser y la ganancia del fotomultiplicador bajo, B) En PMT ganancia más alta, pero no la luz láser, la distribución es más amplia debido a la actual fotomultiplicador oscuro. C) Con el láser y grabado en alta ganancia PMT. Una diferencia entre las distribuciones se muestran en B y distribución, esto indicaría que la luz de excitación llega a los detectores PMT. D) La distribución de las señales de fluorescencia grabado en alta ganancia de neurona somata. Si no hay ninguna otra fuente de ruido contribuye, esta distribución surge de fotón único disparo-ruido. . Jpg &quot;/&gt; Figura 3 A) Imagen de marco completo de fluorescencia para detectar y seleccionar las posiciones de neuronas Somata, B) trayectoria de exploración de un ciclo, C) Ilustración del principio tramado;. En cada Soma (círculo) varios lugares se registran antes de mover el haz hacia la siguiente soma, D) Ilustración de la salida del convertidor D / dos canales A. Para cada soma neuronal, la señal de fluorescencia se registraron desde 4 puntos diferentes en cada soma (S1-S4). La ubicación de cada punto viene dada por su posición x e y. El posiciones x e y para todos los puntos y las neuronas se envían todos al convertidor digital a analógico de una manera secuencial. Mientras que el haz se mueve entre dos cuerpos celulares de neuronas, la señal no ha adquirido (en blanco). E) Los ejemplos de señales de fluorescencia. Tenga en cuenta que cada ejemplo se muestra la respuesta a una espiga (según se mide con electrofisiológico celular conectado a la grabación). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> Figura 4. Estudiar cortifunción de cal usando tramado aleatorio escaneado en acceso. A) Medición de la información mutua señalado por poblaciones de neuronas. La imagen superior muestra una fotomicrografía de cortes de cerebro agudo y dos pipetas de estimulación situados en la misma columna cortical en la capa 4 (L4). Centro gráficos muestran respuestas neuronales para cada repetición de un estímulo. Gráfico inferior muestra la información mutua de Shannon señalado por la población registrada de neuronas. B) Medición de propagación de la actividad suprathreshold enriquecimiento (propagación de la señal) entre las poblaciones de neuronas corticales. Gráfico superior ilustra el diseño experimental, la imagen del centro muestra la imagen de fluorescencia, las líneas punteadas indican las fronteras barril, gráfico inferior muestra picos detectados en respuesta a la estimulación eléctrica de las fibras talamocorticales (triángulos).

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	<li>Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+single+neurons+using+random-access+multiphoton+(RAMP)+microscopy.">Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy.</a> J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73 (1990).</li><li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision.">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. 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N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+[Ca2+]i+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb.">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li><li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+compensation+for+spatial+and+temporal+dispersion+of+acousto-optical+deflectors+for+two-dimensional+scanning+with+a+single+prism.">Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism.</a> Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).</li><li>Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+neuronal+activity+at+high+frame+rate+with+a+digital+random-access+multiphoton+(RAMP)+microscope.">Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope.</a> J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).</li><li>Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+inference+from+calcium+imaging+using+sequential+Monte+Carlo+methods.">Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods.</a> Biophys. J. 97, 636-655 (2009).</li><li>Yaksi, E., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+firing+rate+changes+across+neuronal+populations+by+temporally+deconvolved+Ca2++imaging.">Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging.</a> Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).</li><li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex.">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Dithered azar escaneado en acceso indirecto detecta actividad suprathreshold adición de los incrementos en el calcio intracelular somático asociado con cada aumento en una somata neurona. Los incrementos en el calcio intracelular se detecta por los colorantes de calcio fluorescentes. Las limitaciones de interpolado de acceso aleatorio escaneado surgen en gran medida de la de la limitada señal-a-ruido de las señales de fluorescencia de calcio. La relación de señal-a-ruido es a su vez limitada por fotodaño, que no ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Los componentes ópticos se enumeran en orden, empezando por el láser </td></tr><tr><td> Titan: Sapphire láser </td><td> Coherente Inc. </td><td> Camaleón Ultra 2 </td><td> Alta potencia de salida recomendado (&gt; 2 W a 900 nm) </td></tr><tr><td> Lente acromático f = 30 mm </td><td> Thor laboratorios </td><td> AC254-030-B </td><td> Anti-reflejo (AR) 650-1050 nm para </td></tr><tr><td> Lente acromático f = 100 mm </td><td> Thor laboratorios </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Objetivo f = 75 mm </td><td> Thor laboratorios </td><td> LA1608-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Objetivo f = 175 mm</td><td> Thor laboratorios </td><td> LA1229-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromático f = 300 mm </td><td> Thor laboratorios </td><td> AC254-300-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromático f = 100 mm </td><td> Thor laboratorios </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromático f = 100 mm </td><td> Thor laboratorios </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Acústico-óptico deflectores </td><td> Intraaction Corp </td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td> Rejilla de difracción reflectante </td><td> Newport </td><td> 53-011R </td><td> 100 surcos / mm para los ordenadores delegados con ancho de banda de 65 MHz ángulo de exploración de 45 mrad </td></tr><tr><td> 21,6 mm Brewster prismas </td><td> Lambda Investigación Optics Inc. </td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio coloreado </td><td> Schott </td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td> Espejo dicroico </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td> Módulos fotomultiplicadores </td><td> Hamamatsu </td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADC bordo </td><td> National Instruments </td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Bapta-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optical recording of suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution

Señalización de información en el sistema nervioso central de vertebrados se realiza a menudo por las poblaciones de neuronas en vez de las neuronas individuales. También propagación de la actividad suprathreshold spiking implica poblaciones de neuronas. Los estudios empíricos que abordan directamente la función cortical por lo tanto requieren las grabaciones de las poblaciones de neuronas con alta resolución. Aquí se describe un método óptico y un algoritmo de deconvolución para registrar la actividad neuronal de hasta 100 neuronas con resolución unicelular y único punta-. Este método se basa en la detección de los aumentos transitorios en la concentración intracelular de calcio somático asociado con picos suprathreshold eléctricas (potenciales de acción) en las neuronas corticales. Alta resolución temporal de las grabaciones ópticas se consigue mediante una técnica de escaneo rápido de acceso aleatorio utilizando deflectores acústico-ópticos (ordenadores delegados) 1. Excitación de dos fotones de los resultados sensible al calcio de tinte en una alta resolución espacial en tis cerebrales opacosdemandar 2. Reconstrucción de los picos de las grabaciones de fluorescencia de calcio se consigue mediante un método de máxima probabilidad. Simultáneas registros electrofisiológicos y óptica indican que nuestro método detecta de forma fiable espigas (&gt; 97% de eficiencia de detección de pico), tiene una baja tasa de detección de falsos positivos espiga (&lt;0,003 espigas / s), y una alta precisión temporal (aproximadamente 3 ms) 3. Este método óptico de detección de pico puede utilizarse para registrar la actividad neuronal in vitro y en animales anestesiados in vivo 3,4.

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

La comprensión de la función del sistema nervioso central de vertebrados requiere grabaciones de muchas neuronas porque la función cortical surge en el nivel de las poblaciones de neuronas. Aquí se describe un método óptico para registrar la actividad neuronal con suprathreshold resolución unicelular y único punta-, vaciló al azar escaneado en acceso. Este método graba somáticas fluorescencia señales de calcio de hasta 100 neuronas con alta resolución temporal. Un algoritmo de máxima probabilidad deconvolves la actividad neural subyacente suprathreshold partir de las señales de fluorescencia de calcio somáticas. Este método detecta de forma fiable con los picos de alta eficiencia de detección y una baja tasa de falsos positivos y se puede utilizar para estudiar las poblaciones neuronales<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em&gt;.

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K vistas.  The University of Texas at Austin. La comprensión de la función del sistema nervioso central de vertebrados requiere grabaciones de muchas neuronas porque la función cortical surge en el nivel de las poblaciones de neuronas. Aquí se describe un método óptico para registrar la actividad neuronal con suprathreshold resolución unicelular y único punta-, vaciló al azar escaneado en acceso. Este método graba somáticas fluorescencia señales de calcio de hasta 100 neuronas con alta resolución tempora...

Video: Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

La implantación quirúrgica de electrodos neuronales crónicas para registrar la actividad y señales de una sola unidad electrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Investigación

Neurociencias

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Fabricación de alta densidad, Contacto-Interface plana Electrodos nerviosas para aplicaciones de registro y estimulación

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Análisis de actividad de los nervios y conectividad mediante datos EEG intracraneal con Software SPM

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...