Este protocolo es significativo porque permite la comparación de la microvasculatura entre diferentes regiones del sistema nervioso central, así como entre diferentes individuos. Esta técnica de aislamiento de microcuelos se puede completar en un solo día, y elimina la necesidad de ultracentrifugación y disociación enzimática. Extirpar las meninges y el plexo coroides puede ser difícil.
Asegúrese de trabajar lentamente y cuidadosamente para asegurar la eliminación completa de cada tejido. Para la disección de tejido del SNC de un pequeño espécimen de vertebrado lissencéfalo, coloque el cerebro cosechado en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga solución MV-1 sobre hielo, y use fórceps para recuperar la hipófisis de la sella turcica del cráneo. Coloque la hipófisis en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros de solución mv-1 sobre hielo, y retire la piel y el músculo para exponer la columna vertebral.
Después de extraer las extremidades, la caja torácica y los órganos internos, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para vaciar la columna vertebral con una solución fresca de MV-1, en una dirección caudal-rostral en todo el foramen vertebral lumbar. A continuación, coloque la médula espinal en un tubo de 5 mililitros que contenga una solución de MV-1 fresca. A continuación, coloca el cerebro en una placa de Petri bajo el microscopio de disección y retira las meninges con un pinchazo de doble punta.
Asegúrese de revisar la médula espinal para asegurarse de que no queden trozos de meninges. Utilice los fórceps para separar el hipotálamo, el cerebelo, el tallo cerebral y la corteza. Cuando sea necesario, utilice fórceps e iris y tijeras de resorte para extirpar las bombillas olfativas y el tálamo, y utilice el pinchazo de doble punta para eliminar todo el plexo coroides de todos los ventrículos cerebrales.
Para la disección de tejido del SNC de una gran muestra de vertebrados girofalálicos, utilice un microscopio diseccionador y un pinchazo de doble punta, fórceps y tijeras de iris y resorte para eliminar las meninges de cada tejido del SNC, teniendo cuidado de eliminar cualquier pedazo de plexo coroideo de los ventrículos cerebrales. Para la homogeneización de los tejidos cosechados del SNC, pica cada región del SNC en trozos de uno a dos milímetros dentro de los platos individuales de Petri. Para homogeneizar los tejidos del SNC a partir de pequeñas muestras de vertebrados, utilice una pipeta de transferencia para añadir un mililitro de solución MV-1 para suspender el tejido picado.
Luego utilice la misma pipeta de transferencia para dispensar la corteza, el cerebelo, el tallo cerebral, el lóbulo óptico y las piezas de la médula espinal en amoladoras individuales de tejido de vidrio de 10 mililitros, y utilice un pestillo de PTFE y cinco mililitros de solución MV-1 para moler cada conjunto de tejidos durante unos 10 trazos. Transfiera cada suspensión de tejido en tubos cónicos individuales de 15 mililitros sobre hielo, y use fórceps para colocar el hipotálamo y la hipófisis en 100 microlitros de solución MV-1, en tubos individuales de 1,7 mililitros. Luego, homogeneizar cuidadosamente cada tejido con una micropesta de vidrio.
Para homogeneizar una muestra de vertebrado grande, utilice una pipeta de transferencia de corte biselado para transferir el tejido picado a una trituradora de tejido de vidrio de 55 mililitros, y unir la amoladora a un agitador superior. Agregue la mitad del volumen recomendado de la solución MV-1 de acuerdo con la porción específica del SNC que se homogeneiza como se indica en la tabla, y encienda el agitador superior a aproximadamente 150 rotaciones por minuto. Mueva cuidadosamente el tubo de vidrio hacia arriba y hacia abajo durante unos 30 segundos antes de apagar el agitador superior para agregar más solución MV-1 para una homogeneización adicional, hasta obtener una suspensión homogénea.
A continuación, transfiera el tejido homogeneizado a un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para la purificación de microvajillones, el tejido del SNC homogeneiza por centrifugación y desecha los sobrenadantes. Para un pequeño aislamiento de microvajón de muestra de vertebrados, pipetee la corteza, el cerebelo, el tallo cerebral, el lóbulo óptico y los gránulos de la médula espinal, en cinco mililitros de solución MV-2 fresca y helada por muestra, unas 10 veces, antes de agregar cinco mililitros más de solución MV-2 helada a cada tubo.
Voltear cuidadosamente los tubos para mezclar, y volver a suspender el hipotálamo y pellets pituitarios en un mililitro de solución MV-2. Para el aislamiento de microvajillones de muestras de vertebrados grandes, agregue 20 mililitros de solución de MV-2 helada a la corteza, cerebelo, tallo cerebral y pellets de microvajimos de la médula espinal, y vuelva a suspender los gránulos en un revólver de tubo a 40 rotaciones por minuto durante unos 5 minutos. Al final de la re-suspensión, separar el tejido del SNC lycates por centrifugación, y girar lentamente cada tubo para permitir que el sobrenadante pase a lo largo de la pared para separar cuidadosamente la capa de mielina gruesa y densa en la interfaz líquida de las paredes del tubo.
Deseche las interfaces de mielina y líquido, y borre la pared interior de cada tubo con una espátula envuelta con una toallita de papel de baja pelusa. Luego, utilice una toallita de papel retorcida de baja pelusa para absorber el exceso de líquido, y use puntas de baja unión para volver a suspender cada pellet en un mililitro de solución MV-3. Para la elución y filtración de microvajillones, mezcle unos pocos mililitros de solución de MV-3 fresco para cada lodo de microvajillones de tejido del SNC, y mientras se mezcla para evitar agregados, colalice cada suspensión a través de un colador Pruitt en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.
Coloque un filtro de red de nylon de 20 micrómetros en un soporte de filtro modificado por región del SNC. Transfiera el soporte del filtro a un tubo cónico de 50 mililitros y moje el filtro con cinco mililitros de solución MV-3 helada, asegurándose de que el tampón vierta por el soporte del filtro, en el tubo cónico. Transfiera los microvajillones eluidos a cada filtro de red de nylon de 20 micrómetros y enjuague los microvajillones con cinco a 10 mililitros de solución mv-3 helada.
Utilice fórceps para transferir cada filtro a vasos individuales que contengan la solución MV-3 helada, y agite suavemente cada filtro durante unos 30 segundos para separar las microvajillones. Después de transferir a un tubo cónico de 15 mililitros, recoja los microvajillones por centrifugación y utilice una pipeta de baja unión para volver a suspender cada pellet en un mililitro de solución de MV-3 helada. A continuación, transfiera las suspensiones de microvajillones de pequeños especímenes vertebrados a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para centrifugación durante cinco minutos a 20.000 veces G, en cuatro grados centígrados.
Para especímenes de vertebrados grandes, transfiera la suspensión a tubos individuales de centrífuga de cinco mililitros y agregue cuatro mililitros de solución MV-3 para centrifugación durante cinco minutos a 2.000 veces G en cuatro grados centígrados. Los componentes intrínsecos de la unidad neurovascular se pueden detectar en microvasculares, aislados como se ha demostrado, mediante inmunoetiquetado para CD31, PDGFR-beta y aquaporina cuatro, incluidos los microvasculares corticales, cerebelosos, hipófilos, hipotalámicos, cerebrales y espinales. Del mismo modo, se puede visualizar la expresión de la proteína de unión adherens-unión VE-cadherina, las proteínas de unión apretada CLDN5 y Zonula Occludens-1, la angulina-1 de proteína de unión tricelular y las marcas basales chemokina ligando CXCL motif 12, y gamma-glutamyltransferase-1.
Además, la mayoría de los microvajillones están desprovistos de la expresión de actina muscular lisa alfa, lo que indica que este protocolo de aislamiento se dirige selectivamente a microcubares de pequeño calibre. Los microvasculares obtenidos de otros pequeños vertebrados lissencéfalos, como el ave, el mentiroso, la rana y el pez, comparten algunas características morfológicas, lo que sugiere que este método es útil para una mayor caracterización de las diferencias en las unidades neurovasculares entre las especies. La cuantificación de los cambios en la expresión de proteínas revela un aumento en la molécula de adhesión de células vasculares uno, y la molécula de adhesión unión B a lo largo de microvasculares de la médula espinal, durante el pico de la encefalomielitis autoinmune experimental.
Sin embargo, molécula de adhesión de células vasculares uno también se incrementa significativamente en microvasculares pituitarias, y disminuyó en el hipotálamo y microvasculares de tronco cerebral. Además, se observan cambios en la molécula de adhesión de células vasculares una expresión durante la encefalomielitis autoinmune experimental crónica en todos los tejidos del SNC, y en la expresión de la molécula de adhesión de unión B en el hipotálamo y los microvasculares pituitarios. Los análisis cuantitativos, como la mancha occidental, la PCR y la inmunohistoquímica, se pueden realizar siguiendo este procedimiento para revelar información sobre los patrones de expresión de genes y proteínas dentro de la barrera hematoencefálica.
El paraformaldehído es un reactivo agudamente tóxico y siempre debe manipularse bajo la campana de humos mientras se usa un EPP adecuado.
