Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF), la Biología de Sistemas de Señalización el Cáncer (Helmholtz Alianza en Biología de Sistemas) y el Centro Alemán de Investigación Oncológica (DKFZ).

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales del DKFZ. Precaución: Con el fin de evitar la contaminación de las muestras de la ARNasa, tomar precauciones básicas para evitar la contaminación de RNAsa y preparar todos los tampones con agua tratada con DEPC. 1. Preparación de sacarosa Degradados <ol><li> Preparar 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 y 50% de soluciones de sacarosa (ver Tabla 1). Iniciar la preparación de gradientes añadiendo lentamente 2 ml de solución de sacarosa al 50% a la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga polialómero. Congelación de la capa mediante la colocación de los tubos durante 20 min a -80 ° C. </li><li> Agregue las capas posteriores a la disminución de los porcentajes de sacarosa con etapas de congelación en el medio, para terminar con un 17,5% de sacarosa. Mantener gradientes en el hielo durante la adición de soluciones de sacarosa con el fin de evitar la descongelación de las capas subyacentes. </li><li> Preparar gradientes de sacarosa recién un día antes de su uso y mantener a 4 ° C. Alternatively, preparar a los gradientes de antemano, almacenar a -80 ° C y descongelación a 4 ° C la noche antes del experimento. </li></ol> 2. Preparación de Tejidos (Cordón y / o cerebro espinal) <ol><li> Se anestesia el ratón por una sobredosis de xilazina y ketamina en NaCl y transcardially perfundir con 20 ml de solución de sales equilibrada de Hank (HBSS) que contenía 200 g / ml de CHX que inmoviliza los ribosomas en transcripciones asociadas. Confirmar anestesia adecuada por la falta de respuesta a pellizcos del dedo del pie. </li><li> Extracto de tejido rápidamente. Abra la parte dorsal del cráneo y extraer el cerebro. Realizar laminectomía de toda la columna torácica y la columna vertebral lumbar y extraer la médula espinal. Utilice todo el cerebro (~ 400 mg) o una pieza de 4 cm de la médula espinal (~ 90 mg), respectivamente. </li><li> Transferir el tejido en hielo frío homogeneización buffer A (ver Tabla 1) (médula espinal: 1 ml; cerebro: 4 ml) y los dados en trozos pequeños con un bisturí limpio para permitir una mayor captación de cicloheximida. Perform todas las medidas adicionales en el hielo. </li><li> Incubar durante 15 min y homogeneizar el tejido mecánicamente usando un homogeneizador Dounce. Homogeneización controlada cuidadosamente es necesario para asegurar que los núcleos permanecen intactos. Trate todas las muestras de la misma manera para asegurar la comparabilidad. Nota: para el tejido cerebral: Disrupt tejido por 5 golpes con una mano de mortero que cierre bien. Para el tejido de la médula espinal: interrumpir por 5 golpes con una mano de mortero queden flojos, seguido de otros 5 golpes con una mano de mortero que cierre bien. </li><li> Tome alícuotas (400 l para el cerebro y 200 l de la médula espinal), la congelación flash y almacenar a -80 ° C para el aislamiento de ARN total. </li><li> Eliminar los núcleos y células ininterrumpido y fragmentos de tejido por centrifugación a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Centrifugación de baja velocidad evita la pérdida de los ribosomas. </li><li> Fragmentos de membrana Lyse en el sobrenadante libre de núcleos durante 30 min mediante la adición de NP-40 y detergentes desoxicolato de sodio (cada uno a una concentración final de 1%). </li></ol><ol><li> Este paso elimina los componentes grasos de la muestra que de otra manera se puede cubrir la señal en el perfil polyribosome. En primer lugar, los cubos de ultracentrífuga pre contra el frío y el rotor a 4 ° C y se preparan 2 M, 1,1 M y 0,9 M soluciones de sacarosa (ver Tabla 1). </li><li> Mezclar con un lisado de 1,22 volúmenes de solución 2 M de sacarosa y transferir a un tubo de ultracentrífuga de polietileno. Rellene todos los tubos de igual volumen de 10 ml con solución de sacarosa 1,1 M, a partir de entonces cubrirás cuidadosamente con solución de sacarosa 0,9 M. </li><li> Coloque los tubos de ultracentrífuga en cubos ultracentrífuga pre-enfriados. Centrifugar durante 3 horas a 100 000 xg a 4 ° C. Durante este proceso los ribosomas depositarse en el sedimento mientras que los componentes grasos flotan y se mantienen en el sobrenadante. </li></ol> 4. Gradiente de sacarosa Fraccionamiento <ol><li> Aspirar el sobrenadante y disolver el pellet en tampón de homogeneización B (véase la Tabla 1 </stRong&gt;). Medir la absorbancia a 260 nm para cada muestra utilizando un Nanodrop o aparato equivalente y normalizar las cantidades de carga de acuerdo con el valor de la absorbancia. </li><li> Coloque gradientes de sacarosa (la preparación se describe en una sección anterior) en los cubos de ultracentrífuga pre-refrigerados. Muestras de capa con cuidado en la parte superior de la pendiente. Añadir un gradiente de sacarosa en blanco como control técnico. </li><li> Ajustar el peso de cada cubo con tampón de homogeneización. Centrifugar las muestras durante 1,5 horas a 285 000 xg a 4 ° C. </li><li> Iniciar la preparación de la Isco fraccionador 30 minutos antes del final de la centrifugación. Si se utiliza otro modelo de fraccionador, siga el protocolo del fabricante. <ol><li> Ajuste la sensibilidad apropiada (0,2 AUFS para el cerebro o 0,05 AUFS de la médula espinal) para la lámpara UV y encenderlo para calentar. Montar el tubo perforador, conéctelo a través de la bomba de rodillo para solución de sacarosa al 60% a través de la perforación del tubo. </li><li> Prueba de la configuración mediante el bombeo de rata sacarosa (flujoe: 1 ml / min), en particular, asegúrese de que no haya fugas en las tuberías que introducir burbujas en el gradiente. </li><li> Blank absorción de fondo bombeando manualmente tampón de gradiente en el detector UV y la corrección de la línea base. </li></ol></li><li> Retire con cuidado los cubos ultracentrífuga contienen los gradientes de sacarosa con muestras sedimentadas desde el rotor y colocarlos en hielo. Evite cualquier golpes de gradientes para evitar la pérdida de resolución. </li><li> Gradientes se ejecutan en el fraccionador. Ejecute gradientes vacías primera para evaluar la absorción de fondo y asegurar la debida configuración técnica adecuada. <ol><li> Adjuntar gradiente para el detector de UV y perforar la parte inferior del tubo con el tubo perforador. Iniciar el bombeo de 60% de sacarosa, que desplazará el gradiente con muestras sedimentadas hacia arriba a través del detector de UV y en el dispensador gota. </li><li> La absorbancia a 260 nm se documenta para generar el perfil de absorción de la muestra, con picos que indican la sedimentaciónción de los ARNm asociados con subunidades ribosomales, monosomas, y posteriormente el aumento de número de ribosomas. </li></ol></li><li> Recoger las muestras en 20 fracciones a través del gotero dispensador (600 l cada uno, en tubos de 2 ml). </li></ol> 5. Aislamiento de ARN a partir de fracciones individuales <ol><li> Añadir 10% de SDS a una concentración final de 1% a las fracciones individuales y mezclar bien con el fin de desplegar proteínas y disociar los ribosomas. En este punto las muestras se pueden congelar a -80 ° C. Dependiendo de la cuestión a tratar, las fracciones se pueden agrupar de acuerdo con el perfil de absorbancia. </li><li> Aislar ARN con extracción con fenol / cloroformo ácido, lo que también elimina contaminantes trazas de ADN. <ol><li> Añadir un volumen de ácido fenol / cloroformo (precalentado a RT) a cada muestra, el calor durante 10 min a 65 ° C y la presión de liberación bajo la campana de humos después. </li><li> Centrifugar las muestras durante 20 minutos a 17.000 xg a temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo 1,5 mltubo. Esté al tanto de la inversión de fases en las fracciones de sacarosa más densas, donde la fase acuosa puede estar en la parte inferior después de la centrifugación. </li><li> Añadir un volumen de isopropanol, 1/9 volumen de acetato de sodio (pH 5,2) y 1 l GlycoBlue a cada muestra con el fin de precipitar el ARN. Mantener las muestras por lo menos 1 hora a -80 ° C. </li><li> Centrifugar durante 30 minutos a 17.000 xg y 4 ° C. GlycoBlue proporciona una visualización de la pastilla. Aspirar el sobrenadante, lavar pellet una vez con helado de 80% de etanol y pellet se seque al aire. Disolver el pellet en RNasa libre de agua. </li></ol></li><li> Cuantificar cantidad de ARN por Nanodrop y analizar la integridad del ARN por un chip Bioanalyzer. ARN que se obtiene mediante el protocolo presentado es adecuado para todo estado de la técnica ensayos de alto rendimiento, incluyendo microarrays y secuenciación de profundidad. </li></ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Ningún conflicto de interés declarado.

Aunque polyribosome fraccionamiento no es una nueva técnica, sigue siendo un uno particularmente difícil. Basado en el material de entrada, la optimización sustancial puede ser necesario. Este es especialmente el caso de las muestras in vivo del SNC, donde la cantidad de material es a menudo una limitación y componentes del tejido graso dificultan el aislamiento de ARNm traducción. Protocolos de fraccionamiento mayoría de las publicaciones se ocupan de levadura o líneas celulares de mamíferos, y hay protocolos establecidos para el cerebro 12,13,14. Por el contrario, casi no hay publicaciones que describen el fraccionamiento de la médula espinal, y los protocolos anteriores requieren la médula espinal de un gran número de animales que deben ser agrupados 15. Por estas razones, se hicieron varias modificaciones esenciales para adaptar el protocolo de fraccionamiento para los tejidos del SNC, incluyendo ratón única de la médula espinal. Inmovilización del ribosoma con cicloheximida se lleva a cabo durante la perfusión de los animales para evitar la disociación de los ribosomas During el largo proceso de extracción de tejido. Posteriormente, los ARN polysomal se extraen de una manera específica para maximizar el rendimiento polyribosome. En primer lugar, controlado homogeneización del tejido por douncing, mantiene el núcleo intacto y evita la contaminación de ADN. El núcleo se retira a continuación de forma fiable por centrifugación. La combinación de los detergentes NP-40 y desoxicolato de sodio asegura la lisis del retículo endoplásmico y la liberación de su membrana asociada ribosomas. Además, los componentes de absorción de UV dentro de la mielina rica en lípidos oscurecen los perfiles polyribosome. Por lo tanto, la flotación mielina es necesaria, donde se sedimentan compuestos densos tales como polirribosomas y compuestos más ligeros tales como flotador de mielina y se eliminan 16. Polirribosomas A continuación, se sedimentan sobre un gradiente de sacarosa 17,5% a 50%. En lugar de capas de forma manual y congelación de cada capa de sacarosa, gradientes también se pueden preparar usando un mezclador de gradiente. Extracción de ARN a partir de fracciones usando ácido fenol / cloroformo permite DNA a ser retirado con una pérdida mínima de ARN. Sin embargo, la inversión de fase puede tener lugar en fracciones de sacarosa densos (por encima de la fracción 16). Este protocolo proporciona ventajas sobre otros métodos convencionales que abordan el nivel de la traducción. Por ejemplo, tanto la medición de la S6 fosforilado (un marcador traducción prominente), así como el etiquetado de las cadenas nacientes con radioisótopos dan información sobre los niveles de traducción global, pero revelan muy poco sobre lo que específicamente se está traduciendo. Polyribosome fraccionamiento, por otro lado, permite no sólo la evaluación de la traducción global, pero también de la identidad de los ARNm y la traducción de las proteínas reguladoras relacionadas. PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar en RNAs aislados para una lectura rápida de los ARNm seleccionados y microarrays y la secuenciación de próxima generación de ARN se puede realizar para los estudios amplios del genoma. Las optimizaciones presentados aquí permiten la técnica para ser utilizado con cantidades mínimas de tejidos del SNC, por lo tanto, disminuyeing el número de animales necesarios y mejorar la calidad experimental global al reducir el tiempo de procesamiento de tejido. Por otro lado, esta técnica no puede distinguir estancado ribosomas de traducir queridos. Las transcripciones que llevan estancado ribosomas sedimentarán en las fracciones pesadas, y esto debe ser tenido en cuenta al interpretar los datos. Hay técnicas reportadas recientes, a saber RiboTaq y TRAP, en el que los ribosomas son etiquetados con etiquetas de epítopo o reporteros respectivamente de una manera específica del tipo de célula y los ARNm aislados por inmunoprecipitación 17,18 asociadas. Esta técnica puede ser acoplado a polyribosome fraccionamiento para ofrecer alta resolución leer para poblaciones celulares específicas. Pies de impresión ribosoma es otra novedosa técnica que involucra la digestión nucleasa para generar fragmentos pequeños, o &quot;huellas&quot;, de los ARNm que están protegidos por los ribosomas. Bibliotecas continuación, se generan a partir de estas huellas y secuenciados. Este método provIdes un análisis de todo el genoma-codón específico en la traducción y es capaz de identificar estancado ribosomas, no agosto codones de inicio y pequeños marcos de lectura abierta aguas arriba, que no pueden ser alcanzados por polyribosome fraccionamiento 19. Sin embargo, polyribosome fraccionamiento puede estar acoplado a perfiles de ribosoma para el aislamiento de fragmentos digeridos que contienen ribosomas individuales, enriqueciendo así para las especies moleculares necesarios para la preparación de la biblioteca en la que a menudo se requiere una alta pureza de la muestra. Tomados en conjunto, fraccionamiento polyribosome es un método flexible con significación duradera y se puede acoplar a diferentes aplicaciones posteriores, incluyendo ensayos de genoma de ancho como la secuenciación de próxima generación.

La expresión génica se determina por la acción combinada de la transcripción, la traducción y la estabilidad de ARNm y proteínas, con la traducción teniendo el efecto más predominante 1. Ahora es evidente que cada uno de estos pasos es altamente regulado. Micro-RNAs, formación de gránulos de ARN, alternativa y poliadenilación citoplasmática son algunos ejemplos de la regulación post-transcripcional de la expresión génica 2,3. Cada uno de estos mecanismos desacopla la transcripción de la traducción e influye en el proteoma en el sistema biológico de interés. Por lo tanto, como era de esperar, los niveles de ARNm solos son una lectura imperfecta de los niveles de proteína 4. Proteómica cuantitativa proporciona la evaluación más directa de la expresión de genes, sin embargo a pesar de los avances recientes, aún existen limitaciones considerables en la sensibilidad y la resolución de proteínas secuencia. Por lo tanto frente a la translatome, el repertorio de los ARNm traducción, ofrece un excelente compromiso entre el estudio de latranscriptoma y el proteoma. Es más preciso que transcriptómica en la evaluación de la expresión génica final, y proporciona tanto una mayor cobertura y la resolución de la secuencia de la proteómica. En los sistemas de mamíferos, la mayoría de los eventos a través de la iniciación de traducción comienza cap-dependiente. Un grupo de factores de iniciación eucarióticos junto con el 40S subunidad pequeña ribosomal montar en la tapa 5 &#39;de un ARNm. El complejo luego escanea el ARNm y al llegar al codón de inicio AUG, recluta del 60S subunidad ribosomal grande para formar un completo 80S ribosoma. La etapa de elongación procede con el ribosoma se mueve a lo largo del ARNm, con factores de elongación ayudar a la incorporación de aminoácidos de ARNt cargados a la cadena de péptido naciente. Múltiples ribosomas pueden proceder a lo largo de un único ARNm simultáneamente y el número de ribosomas asociados se ha demostrado que se correlaciona con la tasa de síntesis de proteínas 5,6. Esto hace ribosomal carga una indicación fiable para translation y permite la separación de la traducción de ARNm activamente sobre la base de la velocidad de sedimentación. Además de la cuantificación de la traducción de ARNm, información de la secuencia se puede obtener para identificar los motivos implicados en la regulación de la traducción. También ARN proteínas de unión y otros factores de traducción se pueden aislar de diferentes fracciones, facilitar el estudio y descubrimiento de proteínas reguladoras relacionadas. En el sistema nervioso, control de la traducción se ha relacionado con procesos tales como ARNm de almacenamiento, el transporte y la síntesis proteica local. Los conos de crecimiento se ha demostrado que albergar una piscina localizada específica de los ARNm distintos del resto del axón 7. Además, los axones poseen la capacidad de sintetizar proteínas localmente 8,9. Como resultado, el control local de la traducción se ha convertido en un tema crucial de estudio en la neurobiología. El potencial de fraccionamiento polyribosome para abordar este ha sido ilustrada en varios estudios, en los que se utilizó la técnica deinvestigar axón orientación en el desarrollo de la médula espinal, y demostró la traducción dependiente de la actividad de BDNF en el cerebro 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Varios procesos están implicados en la expresión génica, incluyendo la transcripción, la traducción y la estabilidad de los ARNm y proteínas. Cada uno de estos pasos están fuertemente regulados, lo que afecta la dinámica finales de la abundancia de proteínas. Existen diversos mecanismos de regulación en el paso de traducción, lo que hace los niveles de mRNA solo un indicador fiable de la expresión génica. Además, la regulación local de la traducción del ARNm se ha visto especialmente implicado en las funciones neuronales, cambiando &#39;translatomics&#39; para el centro de atención en la neurobiología. El método presentado puede utilizarse para transcriptómica puente y la proteómica. Aquí se describe modificaciones esenciales a la técnica de fraccionamiento polyribosome, que interroga la translatome basado en la asociación de mRNAs traducidos activamente a múltiples ribosomas y su sedimentación diferencial en gradientes de sacarosa. Tradicionalmente, se trabaja con muestras in vivo, en particular de la Central sistema nervioso (CNS), ha demostrado ser un desafío debido a las cantidades limitadas de material y la presencia de los componentes del tejido graso. Para hacer frente a esto, el protocolo descrito se ha optimizado específicamente para su uso con la cantidad mínima de material del SNC, como se demuestra por el uso de ratón única de la médula espinal y el cerebro. Brevemente, los tejidos del SNC se extraen y la traducción de los ribosomas se inmovilizan en los ARNm con cicloheximida. A continuación se realiza la flotación mielina para eliminar los componentes ricas en lípidos. El fraccionamiento se realiza en un gradiente de sacarosa en donde los ARNm se separan de acuerdo con su carga ribosómico. Fracciones aisladas son adecuados para una amplia gama de ensayos de aguas abajo, incluyendo las nuevas tecnologías de ensayo del genoma de ancho.

La Figura 2 muestra los perfiles representativos polyribosome después del fraccionamiento. Los perfiles de cerebro y la médula espinal muestran curvas de absorción características como se ha descrito antes para las líneas celulares. los ARNm unidos a pequeñas subunidades ribosomales (40S) de sedimentos en fracciones más ligeras y aparecen primero como un pico en el perfil, seguido de la subunidad ribosómica grande (60S) y (80S) monosome mRNAs obligado. mRNAs obligado a múltiples ribosomas sedimentos en fracciones más pesadas, con los picos posteriores que indica el aumento de número de ribosomas unidos. Traducción global puede ser evaluada a partir del perfil. Como un ejemplo, el tejido cerebral tiene un polyribosome superior a monosome relación de que el tejido de la médula espinal, lo que indica la traducción más activo. ARN extraído a partir de fracciones individuales se evaluaron por Bioanalyzer, que muestra la distribución de 18S y 28S rRNA. 18S ARNr aparece anteriormente en el perfil, de conformidad con las pequeñas subunidades ribosómicas sedimentación en sucr más ligero<html> fracciones ose. Los rendimientos típicos de ARN total son 10 a 20 g para el cerebro y 2-4 mg de la médula espinal. Los rendimientos de ARN de fracciones individuales son de hasta 4 mg y 0,8 mg para el cerebro y la médula espinal, respectivamente, dependiendo de la fracción. Un gradiente de sacarosa en blanco ya muestra algunas absorción de fondo a 260 nm, debido a la presencia de la TDT. Este fondo se puede restar durante el análisis de datos con el fin de normalizar los valores de muestra. Tratamiento con EDTA se derrumbó los picos polyribosome, lo que demuestra el perfil de sedimentación se debe a la traducción. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Flujo de trabajo y las aplicaciones potenciales de in vivo fraccionamiento polyribosome.&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Perfiles de la Figura 2. (A) polyribosome perfiles típicos de cerebro y la médula espinal, con la evaluación de ARN extraído por Bioanalyzer. (B) Distribución de GAPDH mRNA sobre fracciones mediante QRT-PCR. (C) polyribosome de gradiente de vacío y el cerebro con y sin tratamiento con EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Búfer gradiente 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl 2, NaCl 600 mM, 200 g / ml de cicloheximida (CHX), ditiotreitol 2 mM (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 17,5% </td><td> 8,67 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 25,6% </td><td> 12,8 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 33,8% </td><td> 16,9 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 41,9% </td><td> 20,95 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 50% </td><td> 25 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeneizacióntampón A </td><td> 0,25 M de sacarosa, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 200 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF), 100 U / ml de ARNsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Solución de sacarosa 2M </td><td> 68,4% de sacarosa, Tris-HCl 50, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 100 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M solución de sacarosa </td><td> 38,5% de sacarosa, Tris-HCl 50, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 100 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 M solución de sacarosa </td><td> 30,8% de sacarosa, Tris-HCl 50, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 100 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampón B </td><td> 0,25 M de sacarosa, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, 1% de desoxicolato de sodio </td><td> 200 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml de ARNsin </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de los tampones y soluciones.

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In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K vistas.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas. 

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...