Este sistema de microinyección está diseñado para la infusión de fármacos, electrofisiología y la administración y recuperación de sondas experimentales como microelectrodos y nanosensores. Está optimizado para su uso repetido en animales que se comportan despiertos con daños menores en penetración en los tejidos circundantes. El sistema de microinyección se puede configurar para múltiples propósitos.
La primera es una simple disposición de la cánula para la colocación de una sonda experimental que de otro modo sería demasiado frágil para penetrar la dura mater. La segunda es una infusión microfluídica de un medicamento de forma independiente o acoplada a una cánula que contiene una sonda experimental. Los componentes microfluídicos del sistema permiten la entrega de volúmenes en la escala nanolitros.
Mida la longitud de la cánula y la sonda nanosensor o microelectrodo. La sonda debe ser más larga que la cánula por la longitud que debe sobresalir de la punta de la cánula más aproximadamente un centímetro. Bajo una lupa, cargue la sonda en la cánula a través de la parte posterior para proteger la punta de la sonda.
Inserte la cánula que contiene la sonda en la unión T desde la férula inferior. Coloque el lado superior plano de la cánula en el centro de la unión T. Evite bloquear la unión a través de la cánula retráctil de nuevo a la unión y luego apriétela.
Coloque un tubo en la parte superior del microelectrodo. Carga de nuevo el microelectrodo a través del tubo capilar, la unión T, la cánula y las férulas correspondientes. Corte el microelectrodo a la longitud deseada y raspe el extremo.
Asegúrese de que el extremo posterior del electrodo sobresale a menos de un centímetro de la parte posterior del tubo capilar y que la punta del electrodo sobresale de la cánula a la distancia deseada en el lado inferior. Coloque el terminal de microelectrodo en el pasador de oro y suelde el pasador de oro al terminal de microelectrodo. Añadir pegamento epoxi entre el pasador de oro y la férula superior para fijar el microelectrodo a la férula.
Después de curar el epoxi, preferiblemente durante más de 24 horas, desenrosque la férula superior para asegurarse de que el microelectrodo se retraiga completamente dentro de la cánula. Para construir el circuito microfluídico, coloque una placa ancha sobre una superficie estable. Coloque las dos válvulas de tres vías paralelas a los lados más largos de la placa ancha a unos 12 centímetros de distancia con un puerto uno hacia el otro.
Utilice tornillos para fijar las válvulas a la placa ancha y cortar otros 10 centímetros de tubo capilar para la línea de la regla y colocarlo en el medio. Utilice casquillos estándar para apretar el tubo a los puertos de cara de las válvulas. Corte de 10 a 20 centímetros del tubo capilar y utilice las férulas estándar y los conectores de bloqueo Luer para conectar el tubo de la jeringa a uno de los puertos de la válvula de entrada.
Corte un pequeño trozo de capilar y conéctelo a la válvula de salida como línea de descarga. Corte dos trozos más largos de tubo capilar alrededor de 100 centímetros para conectar la válvula de salida al microinyección. Conecte la bomba de medicamentos y la bomba de marcador a la válvula de entrada.
En primer lugar, asegúrese de que la sonda experimental de microelectrodo esté retraída en la cánula. Para conectar un adaptador a medida al microinyección entredos mediante tornillos, cargue la microinyección a través del tubo guía y fíjelo al adaptador de microconducción hecho a medida utilizando un par de tornillos. Mida la profundidad de la posición del microenlaces en la que el microinyidor sobresale del tubo guía, luego retraiga un centímetro para prepararse para la inserción.
Para experimentos de microinfusión, conecte la línea cerebral a la abertura de unión T no utilizada del microinyección. Utilice una férula estándar y apriete con la llave de la férula. Asegúrese de que la férula superior esté apretada también.
A continuación, coloque la micro drive sobre un vaso de precipitados. Cargue clorhexidina a 20 gramos por litro en la jeringa hermética de un mililitro de gas y colóquela en la bomba de medicamentos. Gire la dirección de flujo de las válvulas y establezca un caudal bajo de 50 a 200 microlitros por minuto de modo que el fluido pase desde la bomba de medicamentos a través de la válvula de entrada hasta la válvula de salida y hacia fuera de la línea cerebral.
Enjuague el circuito con clorhexidina durante un mínimo de 10 minutos. Repita el lavado con solución salina estéril y luego con aire. Aplique suavemente toallitas sin pelusas en las uniones para ayudar a revelar cualquier fuga de líquido a través de las férulas.
El paso más crítico es verificar que el montaje del circuito de inyección y microfluídico no tenga fugas. Cargue el medicamento en la jeringa hermética de gas de 500 microlitrotros, comprima el aire y luego colóquelo en la bomba de medicamentos. Ajuste el flujo a 50 microlitros por minuto y deje que el líquido viaje hasta que queden unas gotas en el microinyección.
A continuación, remoje el tubo guía en clorhexidina a la concentración de 20 gramos por litro durante 15 minutos. Gire la dirección de la válvula de salida hacia la línea de vaciado para desplazar el marcador a medida que avanza la bomba de marcador hasta que se observe un borde claro de color y aceite en la línea de la regla. Asegúrese de que siempre hay aceite entre la droga y el color con el fin de no mezclar los dos materiales solubles en agua y perder el borde afilado entre ellos.
Marque la posición inicial de esta línea de tinte de aceite. Después de la configuración experimental necesaria, retraiga el microelectrodo en la cánula aflojando la férula superior. Fije la microenlazada a la cámara de grabación y baje el tubo guía para penetrar la dura.
A continuación, baje el microinyecyójedo a unos dos milímetros por encima del sitio de grabación ubicado en el cerebro. Apriete la férula superior y conecte los pines dorados al sistema de grabación. Siga avanzando el microinyecto al sitio de destino.
Luego, cambie la válvula de salida a la línea cerebral. Para experimentos de perfusión, utilice la bomba manual de microsyringe para mover la columna de aceite por 0,5 centímetros cada minuto. Una vez infundido el volumen deseado, cambie la válvula de salida hacia la línea de descarga.
En este estudio, inyección de un agonista GABA A a través del área de FEF del hemisferio derecho se realizó para la inactivación reversible del campo ocular frontal mientras que el animal terminó una tarea saccade guiada por la memoria. La gráfica polar muestra el rendimiento de la excentricidad para diferentes ubicaciones en relación con el punto de fijación. El rendimiento disminuyó claramente en el hemifield visual izquierdo dos horas después de la inyección.
Las trazas de Saccade para ocho ubicaciones de memoria periférica antes y después de la inyección de Muscimol en el FEF se muestran aquí. La precisión de la saccada en el hemifield visual izquierdo disminuyó después de la inyección de Muscimol. Una vez completada la configuración, el método es muy fiable y robusto.
Sin embargo, debido a la precipitación de moléculas pequeñas dentro del tubo y los puertos, se requiere un lavado completo antes de cada uso y después de cada experimento con el fin de mantener el microfluido libre de obstrucciones y fugas. Aunque el método se demostró en el campo ocular frontal en un primate no humano, el principio se puede aplicar a cualquier otra región cerebral donde se desea alguna combinación de estimulación eléctrica, registro e inyección de drogas en especies de tamaño de roedores o más grandes. Nuestro sistema tiene la flexibilidad de ser utilizado para grabar de forma independiente o en combinación con la inyección de drogas y tiene la capacidad de colocar con precisión cualquier sonda experimental frágil protegida del daño a través de la dura mater y el tejido neural con un daño tisular mínimo debido a su pequeño diámetro de cánula.
