Questo sistema di microiniettori è progettato per l'infusione di farmaci, l'elettrofisiologia e la consegna e il recupero di sonde sperimentali come microelettrodi e nanosensori. È ottimizzato per l'uso ripetuto in animali che si comportano svegli con piccoli danni da penetrazione ai tessuti circostanti. Il sistema a microiniettore può essere configurato per molteplici scopi.
Il primo è una semplice disposizione della cannula per il posizionamento di una sonda sperimentale che altrimenti sarebbe troppo fragile per penetrare nel dura mater. Il secondo è un'infusione microfluidale di un farmaco indipendentemente o accoppiato a una cannula contenente una sonda sperimentale. I componenti microfluidici del sistema consentono la consegna di volumi in scala nanoliter.
Misurare la lunghezza della cannula e della sonda nanosensore o del microelettrodo. La sonda deve essere più lunga della cannula per la lunghezza che deve sporgere dalla punta della cannula più circa un centimetro. Sotto una lente d'ingrandimento, caricare la sonda nella cannula attraverso la parte posteriore per proteggere la punta della sonda.
Inserire la cannula contenente la sonda nella giunzione T dal ferrule inferiore. Posizionare il lato superiore piatto della cannula al centro della giunzione T. Evitare di bloccare la giunzione tramite la cannula ritraerla nella giunzione e quindi stringerla.
Attaccare un tubo alla parte superiore del microelettrodo. Caricare indietro il microelettrodo attraverso i tubi capillari, la giunzione T, la cannula e le ferrules corrispondenti. Tagliare il microelettrodo alla lunghezza desiderata e raschiare l'estremità.
Assicurarsi che l'estremità posteriore dell'elettrodo sporge a meno di un centimetro dalla parte posteriore del tubo capillare e che la punta dell'elettrodo sporge dalla cannula alla distanza desiderata sul lato inferiore. Posizionare il terminale del microelettrodo nel perno d'oro e saldare il perno d'oro al terminale del microelettrodo. Aggiungere la colla epossidica tra il perno d'oro e il ferrule superiore per attaccare il microelettrodo al ferrule.
Dopo aver curato l'epossidico, preferibilmente per più di 24 ore, svitare il ferrule superiore per assicurarsi che il microelettrodo si ritrae completamente all'interno della cannula. Per costruire il circuito microfluidico, posizionare un'ampia scheda su una superficie stabile. Posizionare le due valvole a tre vie parallele ai lati più lunghi della tavola larga a circa 12 centimetri di distanza l'una dall'altra con una porta rivolta l'una verso l'altra.
Utilizzare le viti per fissare le valvole all'ampia scheda e tagliare altri 10 centimetri di tubi capillari per la linea del righello e posizionarlo nel mezzo. Utilizzare ferrule standard per stringere i tubi alle porte di rivestimento delle valvole. Tagliare da 10 a 20 centimetri del tubo capillare e utilizzare i ferrules standard e i connettori di blocco Luer per collegare il tubo sulla siringa a una delle porte della valvola di ingresso.
Tagliare un piccolo pezzo di capillare e collegarlo alla valvola di uscita come linea di scarico. Tagliare due pezzi più lunghi di tubi capillari di circa 100 centimetri per collegare la valvola di uscita al microiniettore. Collegare la pompa del farmaco e la pompa marcatore alla valvola di ingresso.
In primo luogo, assicurarsi che la sonda sperimentale a microelettrode sia retratti nella cannula. Per collegare un adattatore su misura al microinietto utilizzando viti, caricare in alto il microinietto attraverso il tubo guida e fissarlo all'adattatore di microazionamento su misura utilizzando un paio di viti. Misurare la profondità della posizione del micro azionamento in cui il microinietto sporge dal tubo guida, quindi ritrarlo di un centimetro per prepararsi all'inserimento.
Per gli esperimenti di microinfusione, collegare la linea cerebrale all'apertura della giunzione T inutilizzata del microiniettore. Utilizzare un ferrule standard e stringere con la chiave ferrule. Assicurarsi che anche la ferrule superiore sia stretta.
Quindi, posizionare il micro azionamento su un becher. Caricare la clorexidina a 20 grammi per litro nella siringa stretta a gas da un millilitro e posizionarla nella pompa del farmaco. Ruotare la direzione del flusso delle valvole e impostare una bassa portata da 50 a 200 microlitri al minuto in modo che il fluido vada dalla pompa del farmaco attraverso la valvola di ingresso alla valvola di uscita e fuori dalla linea cerebrale.
Sciacquare il circuito con clorexidina per un minimo di 10 minuti. Ripetere lo sciacquone con soluzione salina sterile e quindi con aria. Applicare delicatamente salviette senza pelucchi alle giunzioni per aiutare a rivelare eventuali perdite di liquido attraverso le ferrules.
Il passaggio più critico è verificare che l'assemblaggio di iniettori e circuiti microfluidici sia privo di perdite. Caricare il farmaco nella siringa a tenuta di gas da 500 microliter, comprimere l'aria e quindi posizionarla nella pompa del farmaco. Regolare il flusso a 50 microlitri al minuto e lasciare che il liquido viaggi fino a quando non vengono lasciate poche gocce nel microiniettore.
Quindi, immergere il tubo guida in clorexidina alla concentrazione di 20 grammi per litro per 15 minuti. Ruotare la direzione della valvola di uscita verso la linea di lavaggio per spostare il marcatore mentre la pompa marcatore è avanzata fino a quando non si osserva un bordo chiaro di colore e olio sulla linea del righello. Assicurati che ci sia sempre olio tra il farmaco e il colore per non mescolare i due materiali solubili in acqua e perdere il bordo affilato tra di loro.
Contrassegnare la posizione iniziale di questa linea di tintura dell'olio. Dopo la necessaria configurazione sperimentale, ritrarre il microelettrodo nella cannula allentando il ferrule superiore. Collegare il micro azionamento alla camera di registrazione e abbassare il tubo guida per penetrare nella dura.
Successivamente, abbassare il microiniettore a circa due millimetri sopra il sito di registrazione situato nel cervello. Stringere il ferrule superiore e collegare i perni d'oro al sistema di registrazione. Continuare ad avanzare il microiniettorio verso il sito di destinazione.
Quindi, passare la valvola di uscita alla linea cerebrale. Per gli esperimenti di infusione, utilizzare la pompa di microsiringa manuale per spostare la colonna di olio di 0,5 centimetri ogni minuto. Una volta che il volume desiderato è stato infuso, passare la valvola di uscita verso la linea di lavaggio.
In questo studio, l'iniezione di un agonista GABA A attraverso l'area FEF dell'emisfero destro è stata eseguita per l'inattivazione reversibile del campo oculare frontale mentre l'animale ha terminato un compito saccade guidato dalla memoria. Il plottaggio polare mostra le prestazioni dell'eccentricità per posizioni diverse rispetto al punto di fissazione. Le prestazioni sono chiaramente diminuite nell'emifield visivo sinistro due ore dopo l'iniezione.
Le tracce saccade per otto posizioni di memoria periferica prima e dopo l'iniezione di Muscimol nel FEF sono mostrate qui. La precisione saccade nell'emifield visivo sinistro è diminuita dopo l'iniezione di Muscimol. Una volta completata la configurazione, il metodo è molto affidabile e robusto.
Tuttavia, a causa della precipitazione di piccole molecole all'interno del tubo e delle porte, è necessario un lavaggio accurato prima di ogni utilizzo e dopo ogni esperimento al fine di mantenere il microfluidico privo di ostacoli e perdite. Sebbene il metodo sia stato dimostrato nel campo oculare frontale in un primate non umano, il principio può essere applicato a qualsiasi altra regione cerebrale in cui si desidera una combinazione di stimolazione elettrica, registrazione e iniezione di droga in specie di dimensioni di roditori o più grandi. Il nostro sistema ha la flessibilità di essere utilizzato per la registrazione in modo indipendente o in combinazione con l'iniezione di farmaci e ha la capacità di posizionare con precisione qualsiasi fragile sonda sperimentale protetta da danni attraverso il dura mater e il tessuto neurale con danni tissutali minimi dovuti al suo piccolo diametro della cannula.
